分子荧光法测定维生素B2的含量.doc

实验项目】分子荧光法定量测定维生素 B2 的含量【实验目的】1. 掌握标准曲线法定量分析维生素 B2 的基本原理2. 了解荧光分光光度计的基本原理、结构及性能，掌握其基本操作 实验原理 】荧光是光致发光任何荧光物质都具有激发光谱和发射光谱 , 发射波长总是 大于激发波长荧光激发光谱是通过测定荧光体的发光通量随波长变化而获得的 光谱，反映不同波长激发光引起荧光的相对效率荧光发射光谱是当荧光物质在 固定的激发光源照射后所产生的分子荧光，是荧光强度对发射波长的关系曲线， 表示在所发射的荧光中各种波长相对强度由于各种不同的荧光物质有它们各自 特定的荧光发射波长，可用它来鉴定荧光物质有些发荧光的物质其荧光强度与 物质的浓度成正比，故可用荧光分光光度法测定其含量维生素B2溶液在430~440nm蓝光的照射下，发出绿色荧光，荧光峰在 535nm 附近维生素B2在pH^6~7的溶液中荧光强度最大，而且其荧光强度与维生素B2 溶液浓度呈线性关系，因此可以用荧光光谱法测维生素 B2的含量维生素B2在碱性溶液中经光线照射会发生分解而转化为另一物质——光黄素，光黄素也是一 个能发荧光的物质，其荧光比维生素 B2的荧光强得多，故测维生素 B2的荧光时溶液要控制在酸性范围内，且在避光条件下进行。

在稀溶液中，荧光强度F与物质的浓度c有以下关系：F= 2.303 ① I0 & be当实验条件一定时，荧光强度与荧光物质的浓度呈线性关系：F=Kc【仪器与试剂 】1. 仪器： 荧光分光光度计（型号： F2500 HITA[H]）；1cm 石英比色皿；50mL容量瓶2. 试剂：维生素B2标准溶液（10.0卩g/mL）（已加乙酸）【实验内容与步骤】1. 系列标准溶液和待测溶液的配制取维生素 B2（ 10.0 卩 g/mL）标准溶液 1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL 分别置于50mL的容量瓶中，标定，摇匀取2.00mL待测溶液于50mL的容量瓶中， 标定，摇匀2. 激发光谱和荧光发射光谱的绘制（用 3.00mLd的标准溶液）设置入Em=520nr为发射波长，在250~400范围内扫描，记录发射波长强度和 激发波长的关系曲线，便得到激发光谱记录最大激发波长设置入Ex为最大激发波长即371 nm在400~600nm范围内扫描，记录发射强 度与发射波长间的函数关系，便得到荧光发射光谱从荧光发射光谱上找出其最大 的发射波长入Em和荧光强度3. 标准溶液及样品的荧光测定将激发波长固定在371 nm荧光发射波长为521 nm测量上述系列标准溶液的 荧光发射强度，按浓度从从低到高测定。

在同样条件下测定未知溶液的荧光强度，并由标准曲线确定未知试样中维生素 B2的浓度实验数据】1. 激发波长入Ex=371 nm 荧光发射波长入Em=521 nm2. 标准溶液剂待测溶液的浓度和荧光强度记录维生素B2溶液浓度（卩g/mL）0.20.40.60.81.0待测溶液相对荧光强度26.7051.7675.3598. 81121.050.38可得待测溶液的浓度为0.393卩g/mL.【实验图像】1. 以入Em=52（为发射波长，溶液浓度为0.6卩g/mL,在250~400nm范围扫描得到的荧光强度和激发波长的关系曲线3. 设置激发波长为371 nm溶液浓度为0.6卩g/mL, 在 400~600nm范围内扫描,所得发射强度与发射波长间的荧光发射光谱如下：Sial rwJ叫EI1血0讪12应］5Z1D3HD73OT5DQCFEBE-3. 以激发波长入Ex=371 nm 荧光发射波长入Em=521 nm测量系列标准溶液浓度, 以标准溶液的荧光发射强度为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标，制作标准曲线如 下：【结果分析与讨论】1. 石英皿是四面透光的，拿的时候不能接触到四个透光面，只能拿上下角部，擦 外壁残留液时由于擦镜纸不吸水，故可先用吸水纸巾擦干，再用擦镜纸擦。

2. 本次实验所得到的R值为0.99977，而理论R值为1,相关度很接近，说明准确 度比较高，溶液配制比较准确3. 配制好的溶液应尽快测量，避免久置成分变化而影响结果4. 干扰荧光分光分光度法的因素：(1) 溶剂：同一荧光物质在不同的溶剂中可能表现出不同的荧光性质溶剂的极性 增强，对激发态会产生更大的稳定作用，结果使物质的荧光波长红移，荧光强 度增大2) 温度：升高温度会使非辐射跃迁概率增大，荧光效率降低3) PH :大多数含有酸性或碱性取代基团的芳香族化合物的荧光性质受 PH的影响很大4) 溶液表面活性剂的存在，减少非辐射跃迁的概率，提高了荧光效率5) 溶液中溶解氧的存在，由于氧分子的顺磁性质，使激发单重态分子向三重态的 体系间窜跃速率加大，因而会使荧光效率降低思考题】1、 试解释荧光光度法较吸收光度法灵敏度高的原因？答:原因是由于现代电子技术具有检测十分微弱光信号的能力，并且荧光强度与 激发光强度成正比，提高激发光强度也可以增大荧光强度，使测定的灵敏度提高； 而吸收光度法测定的是吸光度，不管是增大入射光强度，还是提高检测器的灵敏 度，都会使透射光信号与入射光信号以同样的比例增大，吸光度值不会改变，因 此灵敏度不能提高。

2、 维生素B2在pH=6~7时荧光最强，本实验为何在酸性溶液中测定？ 答：因为维生素B2在碱性溶液中经光线照射，会发生分解而转化为光黄素，后者 的荧光比维生素B2的荧光强的多因此，测量时溶液要控制在酸性范围内进行。