《论文_抗菌肽的研究进展及展望(定稿)》.doc

抗菌肽的研究进展王亮赵协常维山山东农业大学动物科技学院摘要：具冇广谱高效杀菌活性的小分子多肽类物质 抗菌肽，是机体非特异性免疫系统的重婆纽•成部分在动植物体内分布广泛，是天然免疫防御系统的一部分据研究表明，抗菌肽对细菌、部分真菌、原虫、 病毒、肿瘤细胞都具冇杀伤作用从目前国内外在抗菌肽研究热点着手,分析阐述了抗菌肽的分类、作用机 理、抗菌肽棊因工程，及抗菌肽在农业、畜牧业中的应用，并对微生物针对杭菌肤的咐药性进行了简单讨论 关键词：抗菌肽;基因工程;耐受性；作川机理；阳离子抗菌肽抗菌肽(Antibacterial pep tide)是生物细胞待定基因编码、经待定外界条件诱导产生的-类多肽， 具有相对分子质量小、热稳定、杀菌范用广、作用机制独特等特点，不仅对细菌、真菌、病毒、支原体、衣 原体、螺旋体及一些活性细胞有杀伤活性，述在免疫调节、激索调节及刺激伤口愈介等方而有重要作用 随着抗生索的大最使用，耐药性的问题越來越严匝，寻找合适的活性物质來替代抗生索是解决这一问题域 冇效的途径抗菌肽具冇水溶性好、热稳定、广谱抗菌及不易引起病原产生耐药性等优点，是理想的抗生素 替代品笔者就目前国内外对抗菌肽的研究及抗菌肽在农业中的应用综述如下。

1发展历程1975年瑞典科学家G. Boman等人［2］等从惜古比天蚕(Hyatophoracecrop i a)蛹中诱导分离得到一种杀菌 肽,并将其命名为cecropino此后，许多抗菌肽柑继被分离、纯化一些抗菌肽的氨棊酸-级结构和基因序 列得到确定80年代，有关抗菌肽的研究主要集中在人型的经济昆虫90年代以来，在继续对人型经济昆虫 进行研究的同时，乂扩展到一些小型昆虫和其它无脊椎及脊椎动物，抗菌肽已成为免疫学和分子生物学研究 的热点2007年3月，科学院昆明动物研究所在动物來源的抗菌肽研究方面取得重要进展研究小组在 单个两栖动物个体中发现了 107种新型的抗菌肽类似多肽，占全世界己知抗菌肽总数的10%左右，并克隆了 372条抗菌肽基因，分属于30个不同的多肽家族，是目前世界上发现的最丰富的抗菌肽资源抗菌肽是一类 很难导致微生物耐药性的新熨抗感染药物多肽，H前世界上已知的抗菌肽共冇1200多种2抗菌肽的分类根据抗菌肽的结构，可将其分为5类:(1)单链无半胱氮酸残基的a ■螺旋,或由无规卷曲连接的 两段a-螺旋组成的肽；（2）富含某些氨基酸残基但不含半胱氨酸残基的抗菌肽；（3）含1个二硫键的抗 菌多肽；（4）有2个或2个以上二硫键、具有卩-折叠结构的抗菌肽；（5）山其它己知功能的较大的多肽 衍生而來的具有抗菌活性的肽。

其中故早分离到的Cecropins和从非洲爪蟾4*分离到的Magainins等属 于第一类抗菌肽，通常也将其称为Cecmpin类抗菌肽，H前对此类抗菌肽的研究也较深入3抗菌肽的作用及机理抗菌肽作用机理的研究主要集中在抗菌肽与质膜的相互作用的问题上抗菌肽与细胞膜的作用大致分 为两类:破坏膜结构的作用和非破坏膜结构的作用其中，阳离子性抗菌肽与革兰氏阴性菌细胞膜的作用过 程研究的较为透彻研究农明，抗菌肽与革兰氏阴性菌细胞膜的和互作用始于抗菌肽与LPS结合并引起细菌 外膜结构改变，进而与内膜结合形成通道，改变膜的通透性并引起呼吸和关的质子运动力的下降和新陈代谢 的丧失，最终影响生物人分子的合成［12］由丁•抗菌肽对细菌细胞壁的透过能力不同，因而，不同抗菌肽及 同一抗菌肽对不同细菌的最小致死浓度也有很大不同3.1胞膜攻击作用首先，抗菌肽分子通过静电作用结合丁•细胞膜带负电荷的磷脂双层，使磷脂双层局部变薄；然后在细胞 膜电势的作用下，抗菌肽分子的疏水部分插入细胞膜，而其两性分子a -螺旋插入膜内，多个抗菌肽分子 共同形成离了通道，使膜通透化；最终改变细胞膜的通透性及细胞能量状态，导致细胞膜去极化，呼吸作 用受到抑制以及细胞A T P含量严重下降，导致靶细胞死亡。

3. 2线粒体攻击作用当抗菌肽MUC7作用于细菌时，在其超微结构中发现线粒体出现肿胀、空泡化、畸脱落、内容物溢出等 现象，因此认为MUC7等抗菌肽的作用机制可能与抑制细胞呼吸冇关3. 3对染色体的破坏作用此类抗菌肽并不破坏膜结构，而是穿过细胞膜或核膜使肿瘤细胞的D\A发生断裂从而引起细胞死亡3.4癌细胞骨架的断裂作用肿瘤细胞的细胞骨架系统发育不完善，抗菌肽可以插入到细胞质膜，使细胞的双分子层发生溶解、微 管崩解,破坏肿瘤细胞骨架的完整性而真核生物细胞膜富含膜蛋白和胆固醇,特别是胆固醇的存在维持 了细胞膜的稳定性，因此对哺乳动物正常的细胞破坏作用不明显另外，哺乳动物细胞中微丝、微管和质膜内层存在许多结合位点，这种高度发达的细胞骨架结构抵抗抗菌肽的破坏作川3. 5其他作用机制通过荧光免疫法和Western印迹杂交法研究发现，抗菌肽可以促进凋亡相关蛋白及其配体的表达，通 过诱导细胞凋亡杀死肿瘤细胞在抗菌肽抑制病毒的繁殖与扩散的研究中发现,抗菌肽可以从核酸的复制、 转录、翻译病毒颗粒包装等全过程抑制细胞内病毒的复制另外某些酶也是抗菌肽的作用靶标4抗菌肽的基因工程4.1天然抗菌肽基因的克隆及表达 迄今为止,多种抗菌肽基因已经被克隆并成功表达。

如抗菌肽 Magainin在酵母中成功衣达，重组抗菌肽sacotoxin TA在人肠杆菌细胞中获得衣达，天蚕抗菌肽A在昆虫 系统中得到表达另外,朱嘉明等将天蚕抗菌肽八与蜂毒肽朵合肽基因转入大肠杆菌中进行了表达国内外 众多研究者在天然抗菌肽基因的克隆及表达方而硕果累累4. 2抗菌肽畢因的设计及人工合成生物技术的发展及对抗菌肽抗菌理化性质和抗菌机制研究的不断深 入，使人工设计并合成具有高效抗菌活性的抗菌肽棊因成为可能人工设计合成的抗菌肽应具有两亲结构和 正电荷.Antonio等人通过对抗菌肽aprotinin的第18〜39位氨基酸残基的序列进行重新设计，得到了-系 列具冇不同特性的新熨抗菌肽；Thennarasu等人合成的防御素类抗菌肽也表现出较强的抗菌活性；郑 青等将人工合成的杂合抗菌肽AD基因克隆到人肠杆菌-酵母穿梭质粒pCLWA上，转化酵母宿主菌AB103，活 性蛋白PAGE和琼脂孔穴扩散法测定活性，结果表明AD基因在酵母中得到了表达人工设计并合成抗菌肽基 因已经成为目前筛选新型抗菌肽的主要手段5抗菌肽的应用前景5.1抗菌肽在农业中的应用5.1.1作物品种的改良 梢物病害多达数百种，儿乎所有作物在生长期内都会遭到不同程度的危害，培育 抗病新品种是防治植物病害的根本途径。

1）抗菌肽基因在模式植物烟草和马铃薯中的表达2）转抗 菌肽基因水稻植株的获得3）转有抗菌肽基因的其他植物5.2用于动物育种及饲料的开发5.2.1转基因动物的研究转基因动物研究方ifli主要集中在提高动物的抗病能力和传染病防治5. 2. 2抗菌肽在饲料工业中的应用高等动物肠道内的抗菌肽能抑制外源性病原菌，而对动物肠道存在的 止常菌群和动物细胞无杀伤作川虽然肠源抗菌肽有选择性杀伤病原菌的优点,但其在动物体内的农达分泌 量却十分冇限应用基因工程手段大量生产动物专一性抗菌肽，并将其用作饲料添加剂，可以使饲养动物对 外源病原菌入侵具有更好的抵抗能力5. 2. 3阳离子抗菌肽阳离子抗菌肽是一类带正电荷的抗菌肽，存在于多种生物体中，在宿主天然免疫中有 重要作用动物受到大量病原物攻击时，特片性免疫系统需要在细胞系的扩用和免疫反应小区分自我与菲我, H反应速度较慢，不足以及时保护机体免受病原物的侵染而抗菌肽诱导反应的结果是广谱抗微生物反应， 无自我和非我Z区分,Jt•至数分钟内即可发生动物的抗菌肽较容易在直接与环境病原物接触的部分发现， 它们参与构成反应迅速的第一道防线此外，阳离子抗菌肽与传统抗生素冇协同效应。

观察到多价阳离子 抗菌肽magainin II与beta-内酰胺类抗生素的协同作用、Pleurocidin与D-环丝氨酸存在着协同作用 Scott等发现抗菌活性强的抗菌肽与传统抗生素的协同性较弱，抗菌活性弱的抗菌肽与传统抗生素的协同 性较强单个动物可以同时表达序列和结构不同的多种阳离子抗菌肽，这些不同结构的抗菌肽之间也可能存 在协同效应6研究展望及存在问题抗菌肽是哺乳动物防御系统的一个乘要组成部分，具有热稳定、水溶性好、广谱杀菌共至冇的能杀真菌、 原虫等优点，而且许多抗菌肽在100C加热lOmin条件下仍能保持一定活力，且对较人的离了强度和较低或 较鬲的P II都有较强的抗性，而对真核细胞几乎无作用，仅作用于原核细胞和发生病变的真核细胞,并且与 抗生素通过阻断人分子生物合成的作用机制完全不同，病源菌不易对其产生耐药性，由此显示了它具冇独特 的研究和应用价值近20年來，人们对昆虫抗菌肽己进行了比较系统的理论和应用研究，但冇关畜禽抗菌肽 基因工程应用研究方面的报道较少从哺乳动物抗菌肽特冇的性质，显示了它具冇以下儿个方面在备牧生产 上的研究和应用前景研究展塑及存在问题6. 1药用前景随着传统抗生索的广泛及长期的应川，许多病源菌对它们产生了耐勿性，而具有广谱抗菌且有独特的抗 菌机制的抗菌肽显然在这方面的应用研究中具明显优势。

随着对抗菌肽结构与活性的关系、抗菌肽作用机 制及其基因表达调控机制认识的不断深化，设计一种高效的、冇利于人类健康的抗菌肽作抗生索替代品是完 金可行的若想将抗菌肽最终开发为具仃实用价值的抗菌药物，其抗菌活性的提高以及对丁哺乳动物细胞的 毒性的降低是首先需要解决的问题已有的对丁-抗菌肽作川机制的研究为此提供了强大的理论支持由于 抗菌肽的亲水侧面要始终与磷脂膜的带负电的酸性头部相结合，它们应该具彳j如下特点：1）在整条肽链上 分布大最正电荷;2）与双亲性细胞膜应该呈现很微弱的结合能力或者-根木不与Z结合,从而不会溶血因此 对抗菌肽进行结构改造而得到哺乳动物细胞毒性降低的结构形式所依据的主要是这一机制现在已经有大 量的研究机构开展了对抗菌肽进行结构改造的工作,这些工作主要是从改变抗菌肽的□-螺旋性质、带电荷 水平以及疏水性方面着手，并収得了很好的结果,这些结杲反过來又促进了对其作用机制的研究6. 2转基因研究及应用仔猪腹泻、奶牛乳房炎及各种病毒性疾病如猪瘟、鸡新城疫等-•直是棘手的疾病，不利于畜牧业的发展 借鉴已成功的昆虫抗菌肽转基因工程，如转棊因蚊子、转棊因马铃聊、转基因水稻等，把特界的抗菌肽基因 转入畜禽特处细胞让其表达，从而产生抗病新品种,不失为一条发展畜牧生产的新思路，前景深远。

6. 3抗菌肽丛因表达调控及抗菌肽添加剂研究研究农明,抗生索添加剂的使用严巫破坏了动物肠道的微牛物平衡，并易在动物体内残甜，严巫影响了 畜产品的品质和人类的健康川基因工程方法生产环保型抗菌肽添加剂，或者，通过H粮因索调控抗菌肽基 因的表达而达到畜产品无抗索化值得进一步研究然而，由于抗菌肽分了小,分离提纯存在一定的闲难,故天然资源有限化学合成和基因工程法茯得抗菌 肽是主要手段，但化学介成抗菌肽成本窩，而通过基因工程在微生物中直接表达抗菌肽基因，则可能对宿主 冇害而不能秋取衣达产物所以，对抗菌肽的结构、构效关系及作用机理还需进一步研究天然抗菌肽來源冇限，提取工艺复杂，成木昂贵，化学介成也存在成木高、批量生产闲难等问题，通过基 因工程获得的抗菌肽抗菌活性、生产困难等问题某些抗菌肽抗菌谱广、杀伤力强，但其对哺乳动物细胞也 有一定的细胞靠性，如何在保持其结构与活性的同时降低其细胞毒性也是需耍解决的问题7展望过去，在-•种抗生素因为耐受性的产生而失去作用时，人们通常通过对其分子进行修饰来寻找新的抗 生索，但不久之后微生物的耐受性依然会出现临床和实验所进行的研究证实了抗菌肤所引起的微生物耐 受性，与传统的抗生索相比，微乎其微，这为解决在临床上日益棘手的。