厚皮甜瓜种质蔓枯病抗性评价与遗传多样性分析.docx
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厚皮甜瓜种质蔓枯病抗性评价与遗传多样性分析 朱凌丽 徐建 姚协丰 徐锦华 李苹芳 柳李旺 羊杏平摘要： 采用苗期蔓枯病接种和单核苷酸多态性（SNP）基因型分析对120份厚皮甜瓜高代自交系进行抗性评价与遗传多样性研究结果显示：光皮类型厚皮甜瓜中高抗、中抗种质资源占比达11.11%，其抗性水平结构优于网纹甜瓜和哈密瓜统计分析结果显示，21个SNP位点的PIC值为0.050～0.478，其中12个中度多态SNP位点的PIC值平均为0.37，表明甜瓜种质的多态性中等群体结构与聚类分析结果表明，124份甜瓜种质资源可分成5大类群，各类群具有一定的独立性，且类群间存在明显的差异，遗传多样性丰富关键词： 厚皮甜瓜;种质资源;蔓枯病;抗性评价;遗传多样性： S652 ： A ： 1000-4440（2021）02-0454-11Abstract： The gummy stem blight （GSB） resistance evaluation and genetic diversity study of 120 high generation inbred lines of muskmelons were conducted via inoculation at seedling stage and single nucleotide polymorphism （SNP） genotype analysis. The results showed that， the proportion of germplasm resources of smoothbark muskmelons with high and medium resistance to GSB was up to 11.11%， and the structure of resistance level was better than that of netted melon and Hami melon. The statistical analysis results showed that， the polymorphism information content （PIC） value of 21 SNP loci ranged from 0.050 to 0.478， and the average PIC value of 12 moderate polymorphic SNP loci was 0.37， indicating that the polymorphism of the melon germplasms was moderate. Results of population structure and clustering analysis showed that， the 124 melon germplasms could be classified into five major groups， and each group showed certain independence. Furthermore， there were obvious differences between different groups and the genetic diversity was abundant.Key words： muskmelon;germplasm resources;gummy stem blight;resistance evaluation;genetic diversity甜瓜是世界范围内重要的经济作物，在热带、亚热带及温带地区广泛种植，具有极高的食用和经济价值。
据联合国粮食及农业组织（FAO）统计，2018年全球甜瓜栽培面积约1.05×106 hm2，其中中国甜瓜栽培面积占总量的34.3%，年总产量1.278×107 t，位居世界之首厚皮甜瓜是食用栽培甜瓜的一种类型，较薄皮甜瓜品质优良，香甜可口，营养丰富，是广受国内外市场欢迎的高档果品随着哈密瓜东移栽培的成功，厚皮甜瓜逐渐成为中国主要的设施栽培瓜类作物[1]但是中国东部地区气候湿润，在保护地栽培的甜瓜极易诱发瓜类蔓枯病，严重时常常造成毁灭性减产[2]生产中主要通过使用化学药剂防治蔓枯病，不仅成本高、效率低，还会引发病原菌的抗药性与环境污染等问题[3]防治实践表明，利用抗源选育抗病品种是防治甜瓜蔓枯病最经济有效的措施[4]因此，利用致病力强的蔓枯病病菌人工接种厚皮甜瓜种质资源，鉴定其抗性，筛选出抗病或耐病的种质，可以从源头上解决蔓枯病问题，并为选育优质抗病品种奠定基础近年来国内甜瓜蔓枯病的研究多侧重于对地方品种的抗病性鉴定[5]，以及蔓枯病抗性遗传关系分析及抗性基因定位[6-7]，亟需对厚皮甜瓜种质资源进行蔓枯病抗性评价而且目前厚皮甜瓜商业品种多为杂交种，育种者为获取其优良特性进行多代自交获得骨干亲本，造成目前厚皮甜瓜种质资源的亲缘关系相近，遗传背景趋于模糊[8]。
因此，利用分子标记鉴定技术，完善厚皮甜瓜种质资源遗传多样性评价体系，明确其种质遗传多样性分布特点，对厚皮甜瓜的品种选育与种质创新以及甜瓜产业的发展都具有重要意义本研究对江苏省农业科学院蔬菜研究所西甜瓜创新团队多年选育的120份厚皮甜瓜高代自交系材料進行蔓枯病抗性鉴定，分析不同类型及地理来源甜瓜种质资源对蔓枯病的抗感性;同时筛选厚皮甜瓜单核苷酸多态性（SNP）引物，对124份甜瓜种质资源的遗传多样性进行分析，以期为厚皮甜瓜核心种质构建、种质创制、抗病新品种选育等研究工作提供理论依据1 材料与方法1.1 材料准备供试甜瓜种质资源共124份（表1），包括厚皮甜瓜120份、薄皮甜瓜（抗蔓枯病对照）3份和厚皮哈密瓜雪里红（感蔓枯病对照）1份其中厚皮甜瓜种质资源为江苏省农业科学院蔬菜研究所从国内不同省份和日本、韩国、东南亚、美国及欧洲等不同国家及地区收集，经多代自交选择获得的高代自交系;薄皮甜瓜引自美国，为抗蔓枯病对照材料;雪里红由新疆农业科学院哈密瓜研究中心培育，为感蔓枯病对照材料厚皮甜瓜中有网纹甜瓜种质资源48份，哈密瓜种质资源43份，光皮甜瓜种质资源27份2017年秋季于江苏省农业科学院蔬菜研究所玻璃温室内进行甜瓜育苗，每份材料種植20个单株，日温25～28 ℃，夜温18～20 ℃，长至2～3张真叶时备用。
蔓枯病病菌[Didymella bryoniae （Auersw.） Rehm]选择DBJSJY2作为接种菌株，该菌株由江苏省农业科学院蔬菜研究所瓜类作物研究室从田间收集、分离、鉴定和保存，致病力强，稳定性好接种前将DBJSJY2接种于马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）固体培养基上，16 h/d光照、26～28 ℃培养1周参照姚协丰等[9]方法利用黄瓜培养蔓枯病病菌分生孢子（图1）用刀片刮取菌块，研磨后以无菌水冲洗，用4层灭菌纱布过滤冲洗液，在显微镜下将分生孢子悬浮液调整为1 ml 5×105个备用1.2 取样及DNA提取对124份甜瓜种质资源叶片用标准打孔器打孔取样，每份资源材料取8张叶片，液氮冷冻保存采用十六烷基三甲基溴化铵/十二烷基硫酸钠（CTAB/SDS）方法提取组织DNADNA溶解后用BioTEK多功能酶标仪测定OD值，包括OD230、OD260、OD280通过1%琼脂糖凝胶于120 V电泳30 min，确定DNA的完整性1.3 蔓枯病病菌苗期接种及病情鉴定参照周晓慧等[10]方法进行苗期接种，在甜瓜苗期3～4叶期时用喷雾器喷洒孢子悬浮液（按1 ml 5×105个的密度，加1% Tween80），喷至植株叶片开始滴水为止。
每份材料处理5株，3次重复，以清水为对照接种后置于拱棚内覆膜并加盖遮阳网，保证湿度在90%以上，温度控制在25 ℃左右，3 d后揭开拱棚甜瓜苗期活体接种后分别在第7 d、11 d、15 d调查统计蔓枯病病害发生情况参照Gabriele等[11]方法，根据植株不同部位发病情况及病斑大小进行抗性分级统计：0级，无症状;1级，叶片发黄（仅疑似感病）;2级，叶片有轻微症状（45% 坏死）;5级，有叶片病死，茎上无症状;6级，叶片有轻微症状（45% 坏死），叶柄和茎秆坏死（>5 mm）;9级，植株死亡平均病情级别数（RI）计算公式：RI=∑（各级值×株数）/总株数根据平均病情级别数确定蔓枯病抗性级别高抗（HR）： RI≤2.0;抗（R）： 2.0
每个SNP位点设计2条SNP特异性引物和1条通用引物，引物由Lifetech公司合成1.5 SNP基因分型验证竞争性等位基因特异性PCR（Kompetitive allele specific PCR，KASP）反应体系：10 ng基因组DNA， 5.00 μl KASP V4.0 2×Master Mix， 0.14 μl KASP 72×assay mix， 加ddH2O至10.00 μl（适用96孔板）其中KASP V4.0 2 ×Master Mix购于LGC公司，包括荧光探针A、荧光探针B、淬灭探针A和淬灭探针B、高保真Taq酶、dNTP等KASP 72×assay mix由浓度为100 μmol/L的SNP1-A1、SNP1-A2、SNP1-C1与ddH2O按照12∶12∶30∶46（体积比）混合组成试验同时设置不加模板的空白对照，每个PCR板中设置1个空白对照梯度PCR反应程序如下：95 ℃ 15 min，10个循环;94 ℃ 20 s，61 ℃（每个循环降0.6 ℃） 退火60 s，26个循环;94 ℃ 20 s，55 ℃退火60 s采用双向单激发读板仪PHERAstar 对PCR扩增产物进行扫描，羧基荧光素（FAM）激发波长为485 nm，发射波长为520 nm，六氨-6-甲基荧光素（HEX）激发波长为528 nm，发射波长为560 nm，系统参比荧光（ROX）激发波长为575 nm，发射波长为610 nm。
采用KrakenTM软件对双向单激发读板仪PHERAstar进行扫描数据分析：聚合在接近X轴、显示蓝色的样本基因型为连接FAM荧光标签序列的等位基因，聚合在接近Y轴、显示红色的样本基因型为连接HEX荧光标签序列的等位基因，中间显示绿色的样本基因型为上述2种等位基因的杂合型，显示粉色的样本可能是DNA质量或浓度问题而使扩增产物没有明确分型，显示黑色的样本为空白对照[16]1.6 统计分析病情级别统计数据利用DPS统计软件进行相关性分析SNP位点基因型频率数据使用PIC-CALC软件计算分析多态信息量（PIC值）利用Structure 2.3软件计算遗传相似系数，用Structure 2.3软件分析群体结构及其遗传多样性，选择最佳群体组群数（K），并在计算时将K取值范围设置为1～8，重复8次，采用Admixture model，计算△K值作为衡量最佳K值的标准获得聚类矩阵，利用Structure软件进行数学模型聚类分析，基于结构程序生成聚类图
