动物检疫学高致病性禽流感.ppt

高致病性禽流感高致病性禽流感(avian Influenza) 1•高致病性禽流感是禽流行性感冒的简称，高致病性禽流感是禽流行性感冒的简称，它是由它是由A型流感病毒引起的一种禽类传染型流感病毒引起的一种禽类传染病•禽流感病毒感染后可以表现为轻度的呼禽流感病毒感染后可以表现为轻度的呼吸道和消化道症状，死亡率较低；或表吸道和消化道症状，死亡率较低；或表现为较严重的全身性、出血性、败血性现为较严重的全身性、出血性、败血性症状，死亡率较高症状，死亡率较高2Ø 非致病性禽流感非致病性禽流感 不会引起明显症状，仅使染病的禽鸟体内产生病毒不会引起明显症状，仅使染病的禽鸟体内产生病毒抗体Ø 低致病性禽流感低致病性禽流感 可使禽类出现轻度呼吸道症状可使禽类出现轻度呼吸道症状, ,食量减少、产蛋量下食量减少、产蛋量下降，出现零星死亡降，出现零星死亡Ø 高致病性禽流感高致病性禽流感 最为严重，发病率和死亡率高感染的鸡群常常最为严重，发病率和死亡率高感染的鸡群常常““全全军覆没军覆没”” 按病原体的致病性，禽流感可分为按病原体的致病性，禽流感可分为:3•高致病性禽流感因其在禽类中传播快、危高致病性禽流感因其在禽类中传播快、危害大、病死率高等特点，被国际兽疫局定害大、病死率高等特点，被国际兽疫局定为为A类传染病，又称真性鸡瘟或欧洲鸡瘟。

类传染病，又称真性鸡瘟或欧洲鸡瘟现为通报性疫病，我国将其列为一类动物现为通报性疫病，我国将其列为一类动物疫病4近年来出现了禽流感病毒感染人的事例：近年来出现了禽流感病毒感染人的事例：•19971997年中国香港禽流感爆发，有年中国香港禽流感爆发，有1212人感染人感染H H5 5N N1 1型禽流感病毒，型禽流感病毒，6 6人死亡，这是世界上首次证人死亡，这是世界上首次证实禽流感感染人类；实禽流感感染人类；•20032003年年4 4月荷兰发生月荷兰发生H H7 7N N7 7型禽流感，人类感染型禽流感，人类感染者达者达8 89 9人，并出现了死亡病例；人，并出现了死亡病例；•20032003年年1111月月2727日，香港一男童感染禽流感；日，香港一男童感染禽流感；5•20032003年年1212月至月至20042004年年2 2月，韩国、中国台湾、月，韩国、中国台湾、日本、越南、印尼、巴基斯坦、老挝、泰国、日本、越南、印尼、巴基斯坦、老挝、泰国、中国大陆、美国和加拿大等国家和地区相继中国大陆、美国和加拿大等国家和地区相继爆发禽流感，其中在越南和泰国又出现了禽爆发禽流感，其中在越南和泰国又出现了禽流感（流感（H H5 5N N1 1）感染人类的病例，并出现了死）感染人类的病例，并出现了死亡。

亡•20042004年禽流感的大爆发，给世界人民带来极年禽流感的大爆发，给世界人民带来极大的恐慌大的恐慌6•2005年年4月，我国青海湖自然保护区候鸟月，我国青海湖自然保护区候鸟感染感染H5N1毒株，约毒株，约6000多只候鸟死亡多只候鸟死亡•2006年亚洲、欧洲、亚洲均有年亚洲、欧洲、亚洲均有H5N1亚型亚型HPAI爆发•最近国内外有最近国内外有H5N1血清型引起的禽流感血清型引起的禽流感发病率和死亡率都很高，危害巨大发病率和死亡率都很高，危害巨大7病原病原•禽流感病毒属于正粘病毒科流感病毒属禽流感病毒属于正粘病毒科流感病毒属的的A型流感病毒病毒的基因组属于单股型流感病毒病毒的基因组属于单股负链负链RNA•典型的典型的A型流感病毒粒子呈圆球形，有囊型流感病毒粒子呈圆球形，有囊膜，对乙醚、氯仿、丙酮等脂溶剂敏感膜，对乙醚、氯仿、丙酮等脂溶剂敏感8鸡瘟病毒鸡瘟病毒9•根据流感病毒的血凝素根据流感病毒的血凝素(HA)和神经氨酸和神经氨酸酶酶(NA)的抗原性差异，可将其分为不同的抗原性差异，可将其分为不同的亚型迄今为止，的亚型迄今为止，A型禽流感病毒的型禽流感病毒的HA已发现已发现16种，种，NA有有9种，分别以种，分别以H1--H16、、N1—N9命名。

命名• 所有的禽流感病毒均属所有的禽流感病毒均属A型，不同毒株型，不同毒株的致病性有差异的致病性有差异10•禽禽流感病毒能在鸡胚上生长繁殖以尿囊流感病毒能在鸡胚上生长繁殖以尿囊腔、羊膜腔或绒毛囊膜上感染时，强毒株腔、羊膜腔或绒毛囊膜上感染时，强毒株病毒初代感染鸡胚后病毒初代感染鸡胚后26-36h26-36h死亡禽流感死亡禽流感病毒通过鸡胚继代后增强毒力病毒通过鸡胚继代后增强毒力•除鸡胚外，本病毒也能感染鸭胚和鸽胚除鸡胚外，本病毒也能感染鸭胚和鸽胚•犬肾细胞（犬肾细胞（MDCKMDCK）广泛用于流感病毒的分）广泛用于流感病毒的分离培养非洲绿猴肾细胞（离培养非洲绿猴肾细胞（VeroVero）也适用）也适用于于A A型流感病毒的分离培养型流感病毒的分离培养11•流感病毒能凝集鸡、豚鼠、猫、小白鼠、流感病毒能凝集鸡、豚鼠、猫、小白鼠、马、绵羊、人和其他动物红细胞马、绵羊、人和其他动物红细胞•对干燥和低温的抵抗力强低温和冻干对干燥和低温的抵抗力强低温和冻干状态下可保存病毒状态下可保存病毒•不耐热不耐热，，病毒经病毒经55℃55℃、、1h1h灭活，灭活，60℃60℃经经20min20min灭活，灭活，100℃ 2100℃ 2分钟即被灭活分钟即被灭活。

12•常用消毒剂容易将其灭活，如氧化剂、常用消毒剂容易将其灭活，如氧化剂、稀酸、漂白粉和碘剂等都能迅速破坏其稀酸、漂白粉和碘剂等都能迅速破坏其活性 13流行病学流行病学•各种家禽（火鸡、鸡、珠鸡、石鸡、鹤鹑、各种家禽（火鸡、鸡、珠鸡、石鸡、鹤鹑、雉、鹅及鸭）和野禽（包括鸭、鹅、矶鹬、雉、鹅及鸭）和野禽（包括鸭、鹅、矶鹬、燕鸥、鹭、海鸥、天鹅等）均易感燕鸥、鹭、海鸥、天鹅等）均易感•从迁徙水禽，尤其是鸭中分离的病毒最多；从迁徙水禽，尤其是鸭中分离的病毒最多；•流感在家禽中对火鸡和鸡的危害最严重流感在家禽中对火鸡和鸡的危害最严重 14•现在发现，禽流感病毒能直接感染人，并可现在发现，禽流感病毒能直接感染人，并可引起发病甚至死亡引起发病甚至死亡•在实验室人工试验中，猪、水貂、猴、猫等在实验室人工试验中，猪、水貂、猴、猫等均可被禽流感病毒感染均可被禽流感病毒感染15•禽流感病毒可通过消化道和呼吸道进入人禽流感病毒可通过消化道和呼吸道进入人体传染给人，也可经过眼结膜和破损皮肤体传染给人，也可经过眼结膜和破损皮肤引起感染引起感染•人类直接接触受禽流感病毒感染的家禽及人类直接接触受禽流感病毒感染的家禽及其粪便或直接接触禽流感病毒也可以被感其粪便或直接接触禽流感病毒也可以被感染，并可引起发病甚至死亡。

染，并可引起发病甚至死亡16•流行特点：流行特点：发病急发病急、、传播快传播快、、流行范围流行范围广广，，常呈地方性或大面积流行常呈地方性或大面积流行，，其中高其中高致病性禽流感的发病率与死亡率均可高致病性禽流感的发病率与死亡率均可高达达100%100% •该病一年四季均可流行，但以冬季和气该病一年四季均可流行，但以冬季和气温骤冷骤热的季节更易暴发温骤冷骤热的季节更易暴发17临床检疫临床检疫 1、临床症状、临床症状•禽流感的症状依感染禽类的品种、年龄、禽流感的症状依感染禽类的品种、年龄、性别、并发感染程度、病毒毒力和环境性别、并发感染程度、病毒毒力和环境因素等而有所不同，主要表现为呼吸道、因素等而有所不同，主要表现为呼吸道、消化道、生殖系统或神经系统的异常消化道、生殖系统或神经系统的异常18•病鸡头部肿胀，冠和肉髯发黑，眼分泌物增多，眼病鸡头部肿胀，冠和肉髯发黑，眼分泌物增多，眼结膜潮红、水肿，羽毛蓬松无光泽，体温升高；结膜潮红、水肿，羽毛蓬松无光泽，体温升高；•下痢，粪便黄绿色并带多量的黏液或血液；下痢，粪便黄绿色并带多量的黏液或血液；•呼吸困难，歪头；呼吸困难，歪头；•产蛋率急剧下降或几乎完全停止，蛋壳变薄、褪色、产蛋率急剧下降或几乎完全停止，蛋壳变薄、褪色、无壳蛋、畸形蛋增多；无壳蛋、畸形蛋增多；•鸡脚鳞片下呈紫红色或紫黑色。

鸡脚鳞片下呈紫红色或紫黑色•在发病后的在发病后的5d～～7d内死亡率几乎达到内死亡率几乎达到100%•少数病程较长或耐过未死的病鸡出现神经症状，包少数病程较长或耐过未死的病鸡出现神经症状，包括转圈、前冲、后退、颈部扭歪或后仰望天等括转圈、前冲、后退、颈部扭歪或后仰望天等 192020肉髯发绀肉髯发绀2121鸡冠和肉垂肿胀发绀鸡冠和肉垂肿胀发绀2222232324 脚磷片下出血252627神经症状 呼吸症状28禽禽流流感感病病鸭鸭具具有有神神经经症症状状29302、病理变化、病理变化 •最急性型病鸡常无眼观变化最急性型病鸡常无眼观变化•急性者可见头部和颜面浮肿，鸡冠、肉髯肿大急性者可见头部和颜面浮肿，鸡冠、肉髯肿大达三倍以上；皮下有黄色胶样浸润、出血，胸、达三倍以上；皮下有黄色胶样浸润、出血，胸、腹部脂肪有紫红色出血斑；腹部脂肪有紫红色出血斑；•心包积水，心外膜有点状或条纹状坏死，心肌心包积水，心外膜有点状或条纹状坏死，心肌软化；软化；•病鸡胸部肌肉有出血点或出血斑病鸡胸部肌肉有出血点或出血斑•消化道变化表现为腺胃乳头水肿、出血，肌胃消化道变化表现为腺胃乳头水肿、出血，肌胃角质层下出血，肌胃与腺胃交界处呈带状或环角质层下出血，肌胃与腺胃交界处呈带状或环状出血；状出血；•肝、脾、肾瘀血肿大，有灰黄色小坏死灶；肝、脾、肾瘀血肿大，有灰黄色小坏死灶；31•呼吸道有大量炎性分泌物或灰黄色干酪样坏死；呼吸道有大量炎性分泌物或灰黄色干酪样坏死；•胸腺萎缩，有不同程度的点、斑状出血；胸腺萎缩，有不同程度的点、斑状出血；•法氏囊萎缩或呈黄色水肿，有充血、出血；法氏囊萎缩或呈黄色水肿，有充血、出血；•母鸡卵泡充血、出血，卵黄液变稀薄；严重者母鸡卵泡充血、出血，卵黄液变稀薄；严重者卵泡破裂，卵黄散落到腹腔中，形成卵黄性腹卵泡破裂，卵黄散落到腹腔中，形成卵黄性腹膜炎，腹腔中充满稀薄的卵黄。

输卵管水肿、膜炎，腹腔中充满稀薄的卵黄输卵管水肿、充血，内有浆液性、黏液性或干酪样物质充血，内有浆液性、黏液性或干酪样物质3233333434353536363737383839394040脚脚鳞鳞出出血血（（严严重重病病例例））4141发病鸡胸肌出血发病鸡胸肌出血产蛋鸡输卵管中的粘液渗产蛋鸡输卵管中的粘液渗出物出物流感病流感病鸡心冠鸡心冠脂肪出脂肪出血血424243434444禽流感病鸭胰腺白坏死点禽流感病鸭胰腺白坏死点 4545鹅 流 感 胰4646实验室检疫实验室检疫•诊断技术诊断技术：：我国已建立琼脂扩散（我国已建立琼脂扩散（AGPAGP）技术、亚）技术、亚型分型技术、病毒分子诊断与检测技术型分型技术、病毒分子诊断与检测技术•国家监测标准：国家监测标准：《《流行性感冒诊断标准及处理原则流行性感冒诊断标准及处理原则》》 471、样品采集：、样品采集：（（1）病料样品：）病料样品：　　　至少从　　　至少从5只病禽和病死禽中采集病料样只病禽和病死禽中采集病料样品　　　样品应包括：泄殖腔（新鲜粪尿样）棉　　　样品应包括：泄殖腔（新鲜粪尿样）棉拭子和气管棉拭子（置于缓冲液体中）；气拭子和气管棉拭子（置于缓冲液体中）；气管和肺的混样；肠管及内容物的混样；肝、管和肺的混样；肠管及内容物的混样；肝、脾、肾、脑等其他组织样品（不能混样）。

脾、肾、脑等其他组织样品（不能混样）48•组织和气管拭子悬液中加入青霉素组织和气管拭子悬液中加入青霉素（（2000IU/ml）、链霉素（）、链霉素（2mg/ml）或庆）或庆大霉素（大霉素（50µg/ml）•肠管及内容物、管及内容物、粪便便样品和品和泄殖腔棉拭泄殖腔棉拭子所用的抗生素浓度应提高子所用的抗生素浓度应提高5倍49（（2）血样：分别采集至少）血样：分别采集至少10只病禽的，并只病禽的，并单独存放，不能混合单独存放，不能混合502 、电镜观察、电镜观察•禽流感病毒一般为球形，直径为禽流感病毒一般为球形，直径为80~120nm，但也常有同样直径的丝状形态，长短不，但也常有同样直径的丝状形态，长短不一•病毒表面有病毒表面有10~12nm的密集钉状物或纤突的密集钉状物或纤突覆盖，病毒囊膜内有螺旋形核衣壳两种覆盖，病毒囊膜内有螺旋形核衣壳两种不同形状的表面钉状物是不同形状的表面钉状物是HA（棒状三聚体）（棒状三聚体）和和NA（蘑菇形四聚体）蘑菇形四聚体） 513 3、病毒分离鉴定、病毒分离鉴定•将感染鸡胚或病禽气管、脾、肺、肾和脑将感染鸡胚或病禽气管、脾、肺、肾和脑等可用磷酸缓冲液或肉汤培养基制成等可用磷酸缓冲液或肉汤培养基制成1010倍倍乳剂，加抗菌素抑菌；如系泄殖腔拭子，乳剂，加抗菌素抑菌；如系泄殖腔拭子，可将拭子在溶液中浸渍后去掉拭子，然后可将拭子在溶液中浸渍后去掉拭子，然后用用2500-3000r/min2500-3000r/min离心离心30min30min，除残渣，滤，除残渣，滤过液接种过液接种9-11d9-11d的的SPFSPF鸡胚尿囊腔分离病毒。

鸡胚尿囊腔分离病毒52•在在35-37℃35-37℃孵化箱内孵育，孵化箱内孵育，18h18h后每后每8h8h观察鸡观察鸡胚死亡情况胚死亡情况•病毒收获：病毒收获：无菌收取无菌收取18h以后的死胚及以后的死胚及96h仍仍存活的鸡胚尿囊液，作血凝试验，以鉴定病存活的鸡胚尿囊液，作血凝试验，以鉴定病毒阳性反应说明可能有正粘病毒科的流感毒阳性反应说明可能有正粘病毒科的流感病毒；若无血凝活性或血凝价很低，则用尿病毒；若无血凝活性或血凝价很低，则用尿囊液继续传囊液继续传2-3代，并重复以上血凝试验，若代，并重复以上血凝试验，若仍阴性，则认为病毒分离阴性仍阴性，则认为病毒分离阴性 534 4、血清学检查、血清学检查•琼脂扩散试验琼脂扩散试验（（AGPAGP）：）：用于流感病毒型的用于流感病毒型的鉴定，是用病毒的核蛋白抗原检查血清中鉴定，是用病毒的核蛋白抗原检查血清中的抗体既可以定性的抗体既可以定性(如免疫双扩散及免疫如免疫双扩散及免疫电泳中以沉淀线判定电泳中以沉淀线判定)，又可以定量，又可以定量(如单辐如单辐射扩散射扩散)比较简便、快捷比较简便、快捷 54•血凝试验（血凝试验（HA）与血凝抑制试验）与血凝抑制试验 （（HIHI）：）：证证实流感病毒的血疑活性及排除实流感病毒的血疑活性及排除NDV，也可，也可用病毒抗用病毒抗原鉴定流感病毒的亚型。

原鉴定流感病毒的亚型•简单的方法是：取简单的方法是：取1滴滴1：：10稀释的正常鸡血清稀释的正常鸡血清(最好最好是是SPF鸡鸡)和和1滴滴ND抗血清，分别滴于瓷板上，再各抗血清，分别滴于瓷板上，再各加加1滴有血凝活性的鸡胚尿囊液，混匀后各加滴有血凝活性的鸡胚尿囊液，混匀后各加1滴滴5﹪的鸡红细胞悬液，若两份血清均出现血凝现象，的鸡红细胞悬液，若两份血清均出现血凝现象，则表明尿囊液中不含有新城疫病毒则表明尿囊液中不含有新城疫病毒(NDV)；如果；如果ND抗血清出现抗血清出现HI现象，表明尿囊液中含现象，表明尿囊液中含NDV55神经氨酸酶抑制试验（神经氨酸酶抑制试验（NITNIT）：）：　　　　利用流感病毒的糖蛋白神经氨酸酶与底物利用流感病毒的糖蛋白神经氨酸酶与底物的反应来检测病毒的存在与否用于鉴定的反应来检测病毒的存在与否用于鉴定AIV另一种表面抗原另一种表面抗原——神经氨酸酶（神经氨酸酶（NA））的亚型56•具体方法是：在具体方法是：在96孔聚苯乙烯平板反应孔中分别加孔聚苯乙烯平板反应孔中分别加入已稀释好的羊膜尿囊液入已稀释好的羊膜尿囊液25µl，然后分别加入，然后分别加入1-9型已处理的型已处理的NA抗血清抗血清25µl，振荡混匀，室温静置，振荡混匀，室温静置1h，每孔加入，每孔加入25µl胎球蛋白，胎球蛋白，37℃孵育孵育3h，每孔，每孔加入加入25µl砷试剂至最先出现棕色的孔褪色，最后每砷试剂至最先出现棕色的孔褪色，最后每孔加入孔加入100µl 1.6%硫酸巴比妥，将反应板用硫酸巴比妥，将反应板用56℃水水漂洗漂洗30-60min后判定结果，呈粉红色为抗血清后判定结果，呈粉红色为抗血清NI阴性，无粉红色为抗血清阴性，无粉红色为抗血清NI阳性。

根据结果判定阳性根据结果判定AIV亚型•NIT实验一般需在实验一般需在AI中心实验室方可进行中心实验室方可进行57•ELISA：具有较高的敏感性，既可以检：具有较高的敏感性，既可以检测抗体，又可以检测抗原尤其适合于测抗体，又可以检测抗原尤其适合于大批样品的血清学调查，可以标准化而大批样品的血清学调查，可以标准化而且结果易于分析在流感的控制、扑灭、且结果易于分析在流感的控制、扑灭、检疫中很有用途检疫中很有用途58中和试验中和试验•以中和试验以中和试验(NT)来鉴定或滴定流感病毒时，来鉴定或滴定流感病毒时，常用鸡胚或组织培养细胞，操作方法与其他常用鸡胚或组织培养细胞，操作方法与其他病毒病毒(如如NDV)的中和试验相同的中和试验相同•取取9-10日龄鸡胚接种后日龄鸡胚接种后37 ℃孵育孵育3-4d，鸡胚，鸡胚死亡出现死亡出现HA活性，表示鸡胚感染流感病毒活性，表示鸡胚感染流感病毒•但由于中和试验的操作相当繁琐，费时间也但由于中和试验的操作相当繁琐，费时间也较长，试验材料耗费也多，没有条件和不必较长，试验材料耗费也多，没有条件和不必要时可不进行要时可不进行 59免疫荧光技术免疫荧光技术 •常用直接荧光抗体法，即在组织触常用直接荧光抗体法，即在组织触(印印)片片上直接染色，以荧光显微镜检查荧光。

上直接染色，以荧光显微镜检查荧光•一种一种AIV的荧光抗体可以用来检测同亚型的荧光抗体可以用来检测同亚型的其他病毒的其他病毒•荧光抗体技术用于诊断，具有快速、简便、荧光抗体技术用于诊断，具有快速、简便、敏感等特点，而且费用较低需要有荧光敏感等特点，而且费用较低需要有荧光显微镜才能观察显微镜才能观察605、分子生物学技术（、分子生物学技术（RT-PCR））•检测禽流感病毒核酸检测禽流感病毒核酸 61检疫后处理检疫后处理•确检禽流感时，立即上报疫情并封锁现场，确检禽流感时，立即上报疫情并封锁现场，对病禽和同群者以及方圆对病禽和同群者以及方圆3km的家禽以不放的家禽以不放血方式扑杀，销毁尸体；血方式扑杀，销毁尸体；•对所有被污染的环境和器具物品进行彻底消对所有被污染的环境和器具物品进行彻底消毒；毒；•对疫区进行封锁，严禁家禽及其产品进出对疫区进行封锁，严禁家禽及其产品进出•禽场要全面清扫、消毒，空舍至三个月禽场要全面清扫、消毒，空舍至三个月 62免疫预防免疫预防•注射禽流感疫苗注射禽流感疫苗 63。