流式细胞仪检测细胞凋亡操作流程.docx

Active Caspase-3检测细胞凋亡实验原理Caspase-3在早期凋亡细胞中就已经活化，是凋亡程序中的重要的Caspase 酶凋亡细胞中，32kD的原酶（Pro-caspase-3）裂解为一个17-21kD亚单位和一个 12kD亚单位，两个亚单位形成二聚体，即为活化的Caspase-3，活化的 Caspase-3又水解、活化其它Caspase酶和多种胞浆内成分（如D4-GDI，Bcl-2） 和核内成分（如PARP）1 1- pH-37一 P17-20一 1— 1Pro-dcwnain MH 产1HCCOHIAcUvaNon b/ C4*av«g«11Acthi« CaspaM*of CaapMea. Caspases are 芻 皿日亦Xwtijyrtivs憎和 車* procr?^f

Active Caspase-3 Apoptosis Kit特为流式细胞术分析凋亡细胞的Caspase-3而 设计包括荧光标记多克隆兔抗Active-Caspase-3抗体(Anti-Active Caspase-3 FITC或Anti-Active Caspase-3 PE)、固定/破膜剂、破膜/冲洗缓冲液实验步骤1 Camptothecin 诱导细胞凋亡在 DNA 合成中，需要拓扑异构酶 I Camptothecin 是拓扑异构酶 I 的抑制 剂，它在体外依剂量不同而影响凋亡的发生在此，Camptothecin做为常规的 凋亡诱导方案，辅助细胞凋亡分析凋亡诱导试验用品1. 用 DMSO 制备 1.0mM 的 Camptothecin 储备液2 Jurkat T 细胞(ATCC TIB-152)凋亡诱导试验步骤1 1x106cells/ml 增殖的 Jurkat T 细胞加入 Camptothecin， Camptothecin 终浓度 为 4-6pM2 细胞37OC孵育4小时2 Active Caspase-3 染色步骤试验用品：1. 12x75mm 的 Falcon 管2. PBS 缓冲液3. 凋亡检测试剂盒ProductCat. No.SizePE Active Caspase-3 Apoptosis Kit包括：PE-conjugated Polyclonal Rabit Anti-Active Caspase-3 AntibodyCytofix/Cytoperm SolutionPerm/Wash Buffer（ 10x）550914100TestsFITC Active Caspase-3 Apoptosis Kit包括：FITC-conjugated Polyclonal Rabit Anti-Active Caspase-3 AntibodyCytofix/Cytoperm SolutionPerm/Wash Buffer（ 10x）550480100Tests染色步骤：1 计算抗体和Perm/Wash Buffer缓冲液用量：每个测试样本加入 100卩1Perm/Wash Buffer缓冲液和20pl抗体（见下表）。

测试样本数细胞总数Perm/Wash Buffer 总体积(ml)抗体总体积（pl）11x106cells0.102055x106cells0.501001010x106cells1.002002020x106cells2.004002 根据用量制备Perm/Wash Buffer （lx），将10x浓度缓冲液使用蒸馏水进行10倍稀释，注意：有时10x浓度的缓冲液内会出现沉淀，属正常现象，在稀 释成lx浓度的缓冲液后，使用0.45卩的滤器过滤即可3 使用冷的PBS缓冲液洗细胞两次，再用Cytofix/Cytoperm Solution调整细胞 浓度为 lxl06cells/0.5ml4 细胞冰浴20分钟5 细胞离心，弃上清室温下，使用 lxPerm/Wash Buffer洗细胞两次，Perm/Wash Buffer 缓冲液的用量为 0.5ml Buffer/1x106cells6 按样本数加入lxPerm/Wash Buffer和抗体，混匀，室温反应30分钟7 每测试管中，用1.0ml的1 xPerm/Wash Buffer洗细胞一次，再用0.5ml的 lxPerm/Wash Buffer制成细胞悬液，在流式细胞仪上进行样本分析。

结果分析未经凋亡诱导的Jurkat cells （ATCC TIB-152）（左图）和经喜树碱诱导4小时的 Jurkat cells （右图）同时上机检测结果显示如下：左图未检测到活化aspase-3 （左 图M2）右图超过1/3的caspase-3发生了活化（右图M2）证明经喜树碱处理， Jurkat cell发生了明显的凋亡」£EnN 3 aAnEPMy5.^11rp (y11C1 瓷名幕凸寸尿窝 0T-0 1亠O3。