电泳技术简介.docx

电泳技术简介电泳法，是指带电荷的供试品（蛋白质、核苷酸等）在惰性支持介质 （如纸、醋酸纤维素、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等）中，于电场 的作用下，向其对应的电极方向按各自的速度进行泳动，使组分分离 成狭窄的区带，用适宜的检测方法记录其电泳区带图谱或计算其百分 含量的方法电泳技术的基本原理和分类在电场中，推动带电质点运动的力（F）等于质点所带净电荷量（Q）与电场强度（E）的乘积F=QE质点的前移同样要受到阻力（F）的影响，对于一个球形质点，服从Stoke定律，即：F'=6nrn v式中r为质点半径，n为介质粘度，v为质点移动速度，当质点在电 场中作稳定运动时：F=F即QE=6nrqv可见，球形质点的迁移率，首先取决于自身状态，即与所带电量成 正比，与其半径及介质粘度成反比除了自身状态的因素外，电泳体 系中其它因素也影响质点的电泳迁移率电泳法可分为自由电泳（无支持体）及区带电泳（有支持体）两 大类前者包括 Tise-leas 式微量电泳、显微电泳、等电聚焦电泳、 等速电泳及密度梯度电泳区带电泳则包括滤纸电泳（常压及高压）、 薄层电泳（薄膜及薄板）、凝胶电泳（琼脂、琼脂糖、淀粉胶、聚丙 烯酰胺凝胶）等。

自由电泳法的发展并不迅速，因为其电泳仪构造复杂、体积庞大，操 作要求严格，价格昂贵等而区带电泳可用各种类型的物质作支持体， 其应用比较广泛本节仅对常用的几种区带电泳分别加以叙述影响电泳迁移率的因素1 •电场强度电场强度是指单位长度（cm）的电位降，也称电势 梯度如以滤纸作支持物，其两端浸入到电极液中，电极液与滤纸交 界面的纸长为20cm,测得的电位降为200V,那么电场强度为200V /20cm = 10V/cm当电压在500V以下，电场强度在2-10v/cm时为 常压电泳电压在500V以上，电场强度在20-200V/cm时为高压电 泳电场强度大，带电质点的迁移率加速，因此省时，但因产生大量 热量，应配备冷却装置以维持恒温2•溶液的pH值溶液的pH决定被分离物质的解离程度和质点的 带电性质及所带净电荷量例如蛋白质分子，它是既有酸性基团（- COOH）,又有碱性基团（NH2）的两性电解质，在某一溶液中所带 正负电荷相等，即分子的净电荷等于零，此时，蛋白质在电场中不再 移动，溶液的这一 pH值为该蛋白质的等电点（isoelctric point，pl） 若溶液pH处于等电点酸侧，即pHVpl,则蛋白质带正电荷，在电场 中向负极移动。

若溶液pH处于等电点碱侧，即pH〉pl，则蛋白质带 负电荷，向正极移动溶液的 pH 离 pl 越远，质点所带净电荷越多， 电泳迁移率越大因此在电泳时，应根据样品性质，选择合适的pH 值缓冲液3•溶液的离子强度电泳液中的离子浓度增加时会引起质点迁移 率的降低其原因是带电质点吸引相反符合的离子聚集其周围，形成 一个与运动质点符合相反的离子氛(ionic atmosphere)，离子氛不 仅降低质点的带电量，同时增加质点前移的阻力，甚至使其不能泳动 然而离子浓度过低，会降低缓冲液的总浓度及缓冲容量，不易维持溶 液的 pH 值，影响质点的带电量，改变泳动速度离子的这种障碍效 应与其浓度和价数相关可用离子强度I表示4.电渗 在电场作用下液体对于固体支持物的相对移动称为电渗(el ectro-osmosis)其产生的原因是固体支持物多孔，且带有可解离 的化学基团，因此常吸附溶液中的正离子或负离子，使溶液相对带负 电或正电如以滤纸作支持物时，纸上纤维素吸附0H-带负电荷，与 纸接触的水溶液因产生也0+，带正电荷移向负极，若质点原来在电 场中移向负极，结果质点的表现速度比其固有速度要快，若质点原来 移向正极，表现速度比其固有速度要慢，可见应尽可能选择低电渗作 用的支持物以减少电渗的影响。

电泳分析常用方法(一) 醋酸纤维素薄膜电泳 醋酸纤维素是提纤维素的羟基乙酰化形成的纤维素醋酸酯由该 物质制成的薄膜称为醋酸纤维素薄膜这种薄膜对蛋白质样品吸附性 小，几乎能完全消除纸电泳中出现的“拖尾”现象，又因为膜的亲水性 比较小，它所容纳的缓冲液也少，电泳时电流的大部分由样品传导， 所以分离速度快，电泳时间短，样品用量少，5pg的蛋白质可得到满 意的分离效果因此特别适合于病理情况下微量异常蛋白的检测醋酸纤维素膜经过冰醋酸乙醇溶液或其它透明液处理后可使膜 透明化有利于对电泳图谱的光吸收扫描测定和膜的长期保存1 •材料与试剂醋酸纤维素膜一般使用市售商品，常用的电泳缓 冲液为pH8.6的巴比妥缓冲液，浓度在0.05-0.09mol/L2 •操作要点⑴膜的预处理：必须于电泳前将膜片浸泡于缓冲液，浸透后，取 出膜片并用滤纸吸去多余的缓冲液，不可吸得过干⑵加样：样品用量依样品浓度、本身性质、染色方法及检测方法 等因素决定对血清蛋白质的常规电泳分析，每cm加样线不超过1 pl,相当于60-80pg的蛋白质⑶电泳：可在室温下进行电压为25V/Cm,电流为0.4-0.6mA/ cm 宽⑷染色：一般蛋白质染色常使用氨基黑和丽春红，糖蛋白用甲苯 胺蓝或过碘酸-Schiff试剂，脂蛋白则用苏丹黑或品红亚硫酸染色。

⑸脱色与透明：对水溶性染料最普遍应用的脱色剂是5 %醋酸水溶 液为了长期保存或进行光吸收扫描测定，可浸入冰醋酸：无水乙醇 =30:70 (V/V)的透明液中二) 凝胶电泳 以淀粉胶、琼脂或琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等作为支持介质 的区带电泳法称为凝胶电泳其中聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacryla mide gel electrophoresis, PAGE）普遍用于分离蛋白质较小分子的 核酸琼脂糖凝胶孔径较大，对一般蛋白质不起分子筛作用，但适用 于分离同工酶及其亚型，大分子核酸等应用较广，介绍如下：1 •琼脂糖凝胶电泳的原理概述琼脂糖是由琼脂分离制备的链状 多糖其结构单元是D-半乳糖和3.6-脱水-L-半乳糖许多琼脂糖链 依氢键及其它力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网孔 型凝胶因此该凝胶适合于免疫复合物、核酸与核蛋白的分离、鉴定 及纯化在临床生化检验中常用于LDH、CK等同工酶的检测2 •琼脂糖凝胶电泳分离核酸的基本技术在一定浓度的琼脂糖凝 胶介质中， DNA 分子的电泳迁移率与其分子量的常用对数成反比； 分子构型也对迁移率有影响，如共价闭环DNA〉直线DNA〉开环双 链DNA。

当凝胶浓度太高时，凝胶孔径变小，环状DNA （球形）不 能进入胶中，相对迁移率为0而同等大小的直线DNA （刚性棒状） 可以按长轴方向前移，相对迁移率大于 0⑴设备与试剂：琼脂糖凝胶电泳分为垂直及水平型两种其中水 平型可制备低浓度琼脂糖凝胶，而且制胶与加样都比较方便，故应用 比较广泛核酸分离一般用连续缓冲体系，常用的有TBE （0.08mol /L Tris・HCl, pH8.5, 0.08mol/L 硼酸，0.0024mol/L EDTA） 和 TH E （0.04mol/L Tris・HClpH7.8，0.2mol/L 醋酸钠，0.0018mol/L E DTA）2）凝胶制备：用上述缓冲液配制0.5%-0.8%琼脂糖凝胶溶液， 沸水浴或微波炉加热使之融化，冷至55°C时加入溴化乙锭（EB）至 终浓度为0.5pg/ml,然后将其注入玻璃板或有机玻璃板组装好的模子 中，厚度依样品浓度而定注胶时，梳齿下端距玻璃板 0.5-1.0mm， 待脱凝固后，取出梳子，加入适量电极缓冲液使板胶浸没在缓冲液下 1mm 处⑶样品制备与加样：溶解于TBE或THE内的样品应含指示染料 （0.025%溴酚蓝或桔黄橙）、蔗糖（10%-15%）或甘油（5%-10%）， 也可使用2.5%Fico II增加比重，使样品集中，每齿孔可加样5-10p g。

⑷电泳：一般电压为5-15V/cm对大分子的分离可用电压5V/c m电泳过程最好在低温条件下进行⑸样品回收：电泳结束后在紫外灯下观察样品的分离情况，对需 要的 DNA 分子或特殊片段可从电泳后的凝胶中以不同的方法进行回 收，如电泳洗脱法：在紫外灯下切取含核酸区带的凝胶，将其装入透 析袋（内含适量新鲜电泳缓冲液），扎紧透析袋后，平放在水平型电 泳槽两电极之间的浅层缓冲液中，100V电泳2-3小时，然后正负电 极交换，反向电泳2分钟，使透析袋上的DNA释放出来吸出含D NA的溶液，进行酚抽提、乙醇沉淀等步骤即可完成样品的回收其它还有低融点琼脂糖法、醋酸铵溶液浸出法、冷冻挤压法等，但各 种方法都仅仅有利于小分子量DNA片段（V1kb=的回收，随着DN A 分子量的增大，回收量显著下降三）等电聚焦电泳技术等电聚焦（isoelectric focusing, IEF）是60年代中期问世的一 种利用有 pH 梯度的介质分离等电点不同的蛋白质的电泳技术由于 其分辨率可达 0.01pH 单位,因此特别适合于分离分子量相近而等电 点不同的蛋白质组分1.IEF的基本原理在IEF的电泳中，具有pH梯度的介质其分布 是从阳极到阴极, pH 值逐渐增大。

如前所述,蛋白质分子具有两性 解离及等电点的特征，这样在碱性区域蛋白质分子带负电荷向阳极移 动，直至某一 pH 位点时失去电荷而停止移动，此处介质的 pH 恰好 等于聚焦蛋白质分子的等电点（pl）同理，位于酸性区域的蛋白质 分子带正电荷向阴极移动，直到它们的等电点上聚焦为止可见在该 方法中，等电点是蛋白质组分的特性量度，将等电点不同的蛋白质混 合物加入有 pH 梯度的凝胶介质中，在电场内经过一定时间后，各组 分将分别聚焦在各自等电点相应的pH位置上，形成分离的蛋白质区 带2・pH梯度的组成pH梯度的组成方式有二种，一种是人工pH 梯度，由于其不稳定，重复性差，现已不再使用另一种是天然 pH 梯度天然pH梯度的建立是在水平板或电泳管正负极间引入等电点 彼此接近的一系列两性电解质的混合物，在正极端吸入酸液，如硫酸、 磷酸或醋酸等，在负极端引入碱液，如氢氧化钠、氨水等电泳开始 前两性电解质的混合物pH为一均值，即各段介质中的pH相等，用 pH0表示电泳开始后，混合物中pH最低的分子，带负电荷最多，p I1为其等电点，向正极移动速度最快，当移动到正极附近的酸液界面 时，pH突然下降，甚至接近或稍低于PI1,这一分子不再向前移动而 停留在此区域内。

由于两性电解质具有一定的缓冲能力，使其周围一 定的区域内介质的pH保持在它的等电点范围pH稍高的第二种两 性电解质，其等电点为pl2,也移向正极，由于pl2〉pl1，因此定位于 第一种两性电解质之后，这样，经过一定时间后，具有不同等电点的 两性电解质按各自的等电点依次排列，形成了从正极到负极等电点递 增，由低到高的线性pH梯度，如图16-3所示3•两性电解质载体与支持介质理想的两性电解质载体应在pl处 有足够的缓冲能力及电导，前者保证pH梯度的稳定，后者允许一定 的电流通过不同 pl 的两性电解质应有相似的电导系数从而使整个 体系的电导均匀两性电解质的分子量要小，易于应用分子筛或透析 方法将其与被分离的高分子物质分开，而且不应与被分离物质发生反 应或使之变性常用的 pH 梯度支持介质有聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、葡聚 糖凝胶等，其中聚丙烯酰胺凝胶为最常应用 电泳后，不可用染色剂直接染色，因为常用的蛋白质染色剂也能和两 性电解质结合，因此应先将凝胶浸泡在5％的三氯醋酸中去除两性电 解质，然后再以适当的方法染色四）其他电泳技术1.IEF/SDS-PAGE 双向电泳法1975年OFarrall等人根据不同 组份之间的等电点差异和分子量差异建立了 IEF/SD S-PAGE双向 电泳。

其中IEF电泳（管柱状）为第一向，SDS-PAGE为第二向（平 板）在进行第一向IEF电泳时，。