实验七、荧光显微镜及激光扫描共聚焦显微镜使用.ppt

实验七实验七-1细胞荧光染色观察与荧光显微镜的使用细胞荧光染色观察与荧光显微镜的使用（示范：细胞形态观察与暗视野显微镜的使用）（示范：细胞形态观察与暗视野显微镜的使用）实验目的与教学要求实验目的与教学要求1.掌握荧光显微镜的成像基本原理及其掌握荧光显微镜的成像基本原理及其使用；使用；2.掌握暗视野显微镜的成像基本原理及掌握暗视野显微镜的成像基本原理及其使用荧光显微镜是一种较为常用的的光学显微镜，其荧光显微镜是一种较为常用的的光学显微镜，其基本原理是利用一定波长的激发光对样品进行激基本原理是利用一定波长的激发光对样品进行激发，使之产生一定波长的荧光，从而用于对样品发，使之产生一定波长的荧光，从而用于对样品结构或其组分进行定性、定位、定量观察检测结构或其组分进行定性、定位、定量观察检测一、荧光显微镜的成像原理一、荧光显微镜的成像原理什么是荧光什么是荧光 ? ?n物质中的电子吸收光的能量由低能状物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能状态时态转变为高能状态，再回到低能状态时释放出的光释放出的光n即：物质吸收短波光，发射出的长波即：物质吸收短波光，发射出的长波光n保持固有的荧光特性保持固有的荧光特性n荧光波长＞激发波长荧光波长＞激发波长n荧光强度极小于激发光的强度荧光强度极小于激发光的强度n有不同程度的衰减有不同程度的衰减n荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、荧光效率荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、荧光效率荧光的性质荧光的性质优点：优点：n检出能力高检出能力高n对细胞的刺激小对细胞的刺激小n能进行多重染色能进行多重染色用途用途：：n物体构造的观察物体构造的观察n荧光的有无、色调比较进行物质判别荧光的有无、色调比较进行物质判别n发荧光量的测定对物质定性、定量分析发荧光量的测定对物质定性、定量分析荧光显微镜的优点和用途荧光显微镜的优点和用途荧光素的特性荧光素的特性1.对细胞结构或组分的定性、定位、半定对细胞结构或组分的定性、定位、半定量研究。

量研究2.作为生物大分子筛选与鉴定的标记物作为生物大分子筛选与鉴定的标记物荧光显微镜技术在生命科学研究中的应用荧光显微镜技术在生命科学研究中的应用二、暗视野显微镜的成像原理二、暗视野显微镜的成像原理通过特殊的暗视野聚光器，使照明光线改通过特殊的暗视野聚光器，使照明光线改变途径，不直接进入物镜，而是倾斜地照变途径，不直接进入物镜，而是倾斜地照射到样品上，由样品表面的绕射光线入射射到样品上，由样品表面的绕射光线入射到物镜内，产生样品的衍射图象到物镜内，产生样品的衍射图象三、试剂与器材三、试剂与器材青蛙、洋葱、人正常肝组织切片和脂肪肝组织切片青蛙、洋葱、人正常肝组织切片和脂肪肝组织切片（（HE染色）染色）甲醇、甲醇、1‰ 丫啶橙、滤纸、吸管、载玻片丫啶橙、滤纸、吸管、载玻片荧光显微镜、暗视野显微镜、普通光学显微镜荧光显微镜、暗视野显微镜、普通光学显微镜四、实验内容和实验步骤四、实验内容和实验步骤1.蛙血细胞染色观察：取少许蛙血蛙血细胞染色观察：取少许蛙血 → 常规血涂片常规血涂片→ 凉干凉干 → 甲醇固定甲醇固定10 min → 1‰ 丫啶橙染色丫啶橙染色5 min → 水洗水洗 → 室室温干燥（滤纸擦干玻片底面）温干燥（滤纸擦干玻片底面） → 荧光显微镜观察（先低倍荧光显微镜观察（先低倍后高倍观察）后高倍观察） （可在同一玻片上观察未荧光染色的血细胞）（可在同一玻片上观察未荧光染色的血细胞）2.取洋葱取洋葱→撕取一小片内表皮撕取一小片内表皮→平面单层铺展于玻片上平面单层铺展于玻片上→室温室温凉干凉干→1‰丫啶橙染色丫啶橙染色5min →水洗（用吸管，小心掉片）水洗（用吸管，小心掉片） →室温干燥（或用滤纸擦干）室温干燥（或用滤纸擦干） →荧光显微镜观察荧光显微镜观察3.暗视野显微镜观察蛙血细胞（示范）暗视野显微镜观察蛙血细胞（示范）4.观察人正常肝组织切片和脂肪肝组织切片（观察人正常肝组织切片和脂肪肝组织切片（HE染色）染色）1.荧光显微镜要在光线尽量暗的环境下观荧光显微镜要在光线尽量暗的环境下观察。

察2.使用荧光显微镜时要注意不要直接观察使用荧光显微镜时要注意不要直接观察激发光源，保护眼睛激发光源，保护眼睛3.暗视野显微镜要在光线尽量暗的环境下暗视野显微镜要在光线尽量暗的环境下观察 五、注意事项五、注意事项六、作业与思考题：六、作业与思考题：1.描述在荧光显微镜下所观察到描述在荧光显微镜下所观察到的实验现象的实验现象2.绘图比较人正常肝组织细胞和脂绘图比较人正常肝组织细胞和脂肪肝组织细胞肪肝组织细胞实验七实验七-2 激光扫描共聚焦显微镜在生命科学中的应用激光扫描共聚焦显微镜在生命科学中的应用 实验目的与要求实验目的与要求1. 掌握激光扫描共聚焦显微镜的成像基本掌握激光扫描共聚焦显微镜的成像基本原理及其在生命科学中的应用原理及其在生命科学中的应用Laser Scanning Confocal Microscope1.普通荧光显微镜的不足普通荧光显微镜的不足2. 使用荧光物质标记细胞中的特定成分或结构，不仅使用荧光物质标记细胞中的特定成分或结构，不仅图像与对比度增强，而且由于许多荧光显微镜的光源使图像与对比度增强，而且由于许多荧光显微镜的光源使用短波长的紫外光，大大提高了分辩率（用短波长的紫外光，大大提高了分辩率（δ=0.61 λ/ NA ）。

但当所观察的荧光标本稍厚时，普通荧光显微镜不但当所观察的荧光标本稍厚时，普通荧光显微镜不仅接收焦平面上的光量，而且来自焦平面上方或下方的仅接收焦平面上的光量，而且来自焦平面上方或下方的散射荧光也被物镜接收，这些来自焦平面以外的荧光使散射荧光也被物镜接收，这些来自焦平面以外的荧光使观察到的图像反差和分辨率大大降低（即焦平面以外的观察到的图像反差和分辨率大大降低（即焦平面以外的荧光结构模糊、发虚，原因是大多数生物学标本是层次荧光结构模糊、发虚，原因是大多数生物学标本是层次区别的重叠结构）区别的重叠结构）一、激光扫描共聚焦显微镜的成像基本原理一、激光扫描共聚焦显微镜的成像基本原理2. 共聚焦扫描显微镜的成像原理共聚焦扫描显微镜的成像原理采用点光源照射标本，在焦平面上形成一个轮廓分明的小的采用点光源照射标本，在焦平面上形成一个轮廓分明的小的光点，该点被照射后发出的荧光被物镜收集，并沿原照射光光点，该点被照射后发出的荧光被物镜收集，并沿原照射光路回送到由双向色镜构成的分光器分光器将荧光直接送到路回送到由双向色镜构成的分光器分光器将荧光直接送到探测器光源和探测器前方都各有一个针孔，分别称为照明探测器。

光源和探测器前方都各有一个针孔，分别称为照明针孔和探测针孔两者的几何尺寸一致，约针孔和探测针孔两者的几何尺寸一致，约100-200nm；；相相对于焦平面上的光点，两者是共轭的，即光点通过一系列的对于焦平面上的光点，两者是共轭的，即光点通过一系列的透镜，最终可同时聚焦于照明针孔和探测针孔这样，来自透镜，最终可同时聚焦于照明针孔和探测针孔这样，来自焦平面的光，可以会聚在探测孔范围之内，而来自焦平面上焦平面的光，可以会聚在探测孔范围之内，而来自焦平面上方或下方的散射光都被挡在探测孔之外而不能成像以激光方或下方的散射光都被挡在探测孔之外而不能成像以激光逐点扫描样品，探测针孔后的光电倍增管也逐点获得对应光逐点扫描样品，探测针孔后的光电倍增管也逐点获得对应光点的共聚焦图像，转为数字信号传输至计算机，最终在屏幕点的共聚焦图像，转为数字信号传输至计算机，最终在屏幕上聚合成清晰的整个焦平面的共聚焦图像上聚合成清晰的整个焦平面的共聚焦图像Confocal Principle每一幅焦平面图像实际上是标本的光学横切面，每一幅焦平面图像实际上是标本的光学横切面，这个光学横短面总是有一定厚度的，又称为光学这个光学横短面总是有一定厚度的，又称为光学薄片。

由于焦点处的光强远大于非焦点处的光强，薄片由于焦点处的光强远大于非焦点处的光强，而且非焦平面光被针孔滤去，因此共聚焦系统的而且非焦平面光被针孔滤去，因此共聚焦系统的景深近似为零，沿景深近似为零，沿Z轴方向的扫描可以实现光学断轴方向的扫描可以实现光学断层扫描，形成待观察样品聚焦光斑处二维的光学层扫描，形成待观察样品聚焦光斑处二维的光学切片把X-Y平面（焦平面）扫描与平面（焦平面）扫描与Z轴（光轴）轴（光轴）扫描相结合，通过累加连续层次的二维图像，经扫描相结合，通过累加连续层次的二维图像，经过专门的计算机软件处理，可以获得样品的三维过专门的计算机软件处理，可以获得样品的三维图像•观察方式：以荧光为主观察方式：以荧光为主•光源：激光（紫外、可见光、近红外）光源：激光（紫外、可见光、近红外）•照明方式：点照明、逐点扫描照明方式：点照明、逐点扫描•成像方式：共聚焦、逐点成像成像方式：共聚焦、逐点成像•输出：实时观测输出：实时观测,数字化图像，可以进行图像处理和定量分析数字化图像，可以进行图像处理和定量分析•多重染色样品的观察多重染色样品的观察LSCM的基本特点3. 共聚焦扫描显微镜在生命科学研究中的应用共聚焦扫描显微镜在生命科学研究中的应用细胞结构、蛋白质（如受体、抗原、抗体、酶、细胞细胞结构、蛋白质（如受体、抗原、抗体、酶、细胞骨架蛋白等基因表达产物）、骨架蛋白等基因表达产物）、DNA、、RNA等等细胞膜流动性（荧光光漂白恢复技术）细胞膜流动性（荧光光漂白恢复技术）细胞内氧自由基活性细胞内氧自由基活性细胞内钙离子浓度变化细胞内钙离子浓度变化膜电位膜电位三、试剂与器材三、试剂与器材青蛙青蛙冷丙酮、冷丙酮、 DAPI 、、甘油甘油/PBS封片剂、滤纸、吸管、载封片剂、滤纸、吸管、载玻片、盖玻片玻片、盖玻片激光扫描共聚焦显微镜激光扫描共聚焦显微镜四、实验步骤四、实验步骤1.取涂有细胞的载玻片（细胞涂在中间），冷丙酮取涂有细胞的载玻片（细胞涂在中间），冷丙酮40C固定固定10 min;2.PBS漂洗漂洗2次，每次次，每次3 min; 3.滴加滴加DAPI溶液溶液100 ul室温孵育室温孵育30 min; 4.PBS漂洗漂洗3次，每次次，每次5min; 5.滴一小滴甘油滴一小滴甘油/PBS封片剂封片剂(pH8.5，，PBS:甘油甘油=1:9，，v/v)封封片片;6.激光扫描共聚焦显微镜观察。

激光扫描共聚焦显微镜观察五、注意事项五、注意事项注意染色时间注意染色时间注意避光注意避光六、作业与思考题：六、作业与思考题：试述激光扫描共聚焦显微镜成像基本原理，并试述激光扫描共聚焦显微镜成像基本原理，并描述实验中所观察的现象描述实验中所观察的现象思考题：思考题：激光扫描共聚焦显微镜观察到的图象为什激光扫描共聚焦显微镜观察到的图象为什么比普通的荧光显微镜的清晰度、层次感要强许多？么比普通的荧光显微镜的清晰度、层次感要强许多？。