ELISA、western_blot、免疫组化、RT_PCR实验方法原理和在SCI论文材料方法、结果中的写作.ppt

免疫学实验技术及荧光定量PCR 内容提要 Ø 抗原和抗体 Ø ELISA Ø Western blot Ø 免疫组化（免疫荧光） Ø Real Time PCR 抗原和抗体 u 抗原的基本知识 u 抗体的基本知识 u 多克隆抗体 u 单克隆抗体 抗原和抗体 抗原的基本知识 l 定义：抗原（antigen）是能够刺激机体产生免疫应答的效应物质（抗体 和致敏淋巴细胞），并能与之特异性结合的物质 l 两个基本特性： 免疫原性（immunogenicity）：能够刺激机体产生抗体和效应T淋巴细胞 的免疫反应能力 抗原性（antigenicity）：与免疫反应最终产 物（如抗体和/或T细胞表面受 体）特异结合的能力 l 完全抗原与半抗原 l 抗原表位（Epitopes）：抗原决定簇 存在于抗原分子中，决定抗原特异性的基本结构 或化学基团是与TCR/BCR及抗体结合的基本单位 抗原和抗体 抗体的基本知识 l 定义：antibody指机体的免疫系统在抗原刺激下，由B淋巴细胞或记忆 细胞增殖分化成的浆细 胞所产生的、可与抗原发生特异性结合的免疫球 蛋白 l 结构与功能： 1）重链轻链 ； 2）超变区是抗原结合位，与抗原表位互补； 3）抗体Fc片段上两结构域共同与细胞膜 Fc受体结合，发挥 不同的生物学效应。

l 应用 医学应用： 1.诊断：各类血清学检测，抗人球蛋白测试，早孕检测等 2.治疗：单克隆抗体疗法（类风湿性关节炎多发性硬化症等），肿瘤治疗 科研应用：免疫共沉淀、免疫印迹、染色质免疫共沉淀、免疫荧光技术、ELISA等 抗原和抗体 多克隆抗体 抗原多个表位诱导多种B细胞克隆增殖与分化，产生多种抗体的混合物 特点： •多抗是单抗的混合物，群体 综合的性质 •更容易捕捉抗原 •特异性相对较差：交叉反应 •抗体的纯化、标记难 抗原和抗体 多克隆抗体制备 动物选择： •兔子（rabbit）：最常用于自制抗体，抗体量较多新西兰,大耳白） •小鼠（mouse）：可用于自制抗体，但抗体量很少BALB/C,昆明鼠） •大鼠（rat）：可用于自制抗体，免疫过程要麻醉动物Wistar大鼠） •羊（sheep、goat）：常用于较大批量地生产抗体（商品） •马（horse）：常用于大批量生产治疗用抗体（商品） •豚鼠（guinea pig）：国外实验室常用 抗原和抗体 多克隆抗体制备 延长抗原的作用时间 增强吞噬作用 刺激抗原提呈 促进细胞因子分泌 诱导淋巴细胞分裂、增殖 影响T细胞“极化” 佐剂的作用机理： 抗原制备： 商品化或自行表达 基础免疫：首次， 抗原用量大，用弗 式完全佐剂（含矿 物油,卡介苗等)。

加强免疫：第2次以后， 抗原量减半，多次，间 隔2-4周，用弗式不完全 佐剂(不含卡介苗). 取血测效价： 加强免疫两次 或三次以后的第7 天取血 放血制备血清： 可一次放血(颈动脉) 也可多次取血(耳静脉) 过程（简单了解）： 抗原和抗体 单克隆抗体 单个抗原表位诱导单种B细胞克隆增生与分化，产生单克隆抗体 什么情况下需要制备单克隆抗体？ 目的蛋白有结构类似物 抗原不纯，无法分开 多抗效果不好（已排除非特异性反应） 希望将抗体用于治疗，研制成药品 希望将抗体用于诊断，研制成诊断试剂 ELISA u 基本原理 u 方法种类 u 实验操作 u 应用 u 常见问题分析 u 写作实例 ELISA 基本原理 Ø 全称：酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay） Ø 原理： （1）固相的抗原或抗体，即“免疫吸附剂”； （2）酶标记的抗原或抗体，称为“结合物” ； 辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP） （3）酶反应的底物 ELISA 方法种类 直接法——检测Ag 将抗原直接固定在固相载体上，加入酶标记的一级抗体，即可 测定抗原总量 优势：操作手续简短，因无须使用二抗可避免交互反应。

缺点：实验中的一抗都得用酶标记，但不是每种抗体都适合做 标记，费用相对提高 ELISA 方法种类 间接法——检测Ab 用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标二抗，加底物显色 优势：二抗可以加强信号，而且有多种选择能做不同的测定 分析不加酶标记的一级抗体则能保留它最多的免疫反应性 缺点：交互反应发生的机率较高 ELISA 方法种类 双抗体夹心法——检测Ag 将已知抗体连接在固相载体上，待测抗原与抗体结合后再与酶 标二抗结合，形成抗体-待测抗原-酶标二抗的复合物，复合物 的形成量与待测抗原成正比适用于某些大分子的具有至少双 表位的抗原，而不能用于小分子半抗原的检测 优势：高灵敏、高专一性，抗原无须事先纯化 缺点：抗原一定得拥有两个以上的抗体结合部位 ELISA 方法种类 其他方法 双抗原夹心法、竞争法、捕获法、基于细胞法 酶底物颜色 HRP3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)+H2O2黄色(450nm) 邻苯二胺(OPD)+H2O2橙红(429nm) 5-氨基水杨酸(5-ASA))+H2O2棕色(550nm) 鲁咪诺+H2O2荧光 AP对硝基苯磷酸酯(P-NPP)黄色(405nm) 4-甲基伞基磷酸酯(4-MuP)荧光 ß-半乳糖苷酶4-甲基伞基-ß-半乳糖苷荧光 ELISA 实验操作 •包被：聚苯乙烯板 •封闭： 0.1~2%BSA，5%脱脂奶粉，1%明胶，10%小牛血清 •孵育：加抗原/抗体 •洗涤：PBST、TBST、PBS等 •显色：避光发色 •结果测定：吸光值 待测孔（P）与阴性对照孔（N）的比值（P：N）大于1.5或2 者为阳性。

ELISA 应用 •ELISA应用的范围很广，而且正在不断地扩大，原则上ELISA可用于检测 一切抗原、抗体及半抗原，可以直接定量测定体液中的可溶性抗原 •检查抗原和半抗原方面：在内分泌方面已经用于检测雌性激素、绒毛膜促 性腺激素、黄体素、胰岛素、皮质醇、促甲状腺素和孕酮等；在血液学方 面可用于检查凝固因子（如第Ⅷ凝固因子）、红细胞抗原及结合球蛋白（ Hapto Globin）等；在肿瘤方面已试用检查甲胎蛋白（AFP）癌胚抗原（ CEA） •检查抗体方面：用ELISA间接法检查抗体，已获得对多种传染病和寄生虫 病的血清学诊断，亦开始广泛用于现场流行病学调查在寄生虫病方面， 它用于对疟原虫、阿米巴、利日曼原虫、锥虫、血吸虫、囊虫、弓浆虫、 肺吸虫、肝吸虫、血丝虫、旋毛虫病等血清学诊断；在免疫性疾病方面有 试用作自身疫病抗体测定以及对过敏的诊断，例如检测各种过敏原的抗体 、DNA抗体及甲状腺球蛋白抗体，红斑性痕疮抗体等等；在卫生学方面 ，可用于检测食品中葡萄球菌肠毒素及沙门氏菌毒素等等 ELISA 常见问题分析 Ø 阴性对照出现阳性结果 •试剂或样品可能被污染，或者由于孔之间的溅洒出现交叉污染。

•酶标板洗板不彻底 •抗体量过多导致非特异结合 •夹心法、捕获法中检测抗体与包被抗体/抗原交互反应 Ø 酶标板整体背景高 •抗体非特异性结合 •底物结合浓度过高或反应时间过长 •底物溶液不新鲜或被污染 •底物孵育过程没有避光 Ø 吸光度数值偏高或偏低 •样品中待检抗原含量太低会导致测试结果偏低 •加入抗体量不合适也会造成结果偏低或偏高 •孵育时间不够长会导致检测结果偏低 •孵育温度不适合 ELISA 写作实例 详细描述 IF = 3.534 ELISA 写作实例 抗体浓度 抗原种类 Abs IF = 3.534 ELISA 写作实例 引用文献 ELISA 写作实例 浓度 时间 ELISA 写作实例 操作手册 ELISA 写作实例 浓度 组别 Western blot u 定义及原理 u 应用 u 实验操作 u 常见问题分析 u 半定量分析 u 写作实例 定义及原理 Ø 定义：又称免疫印迹，是指将蛋白样品转移到固相载体上，而 后 利用相应的抗体来检测目的蛋白的一种方法 Ø 原理： Western blot 应用 Western blot Western Blot 被广泛地应用于蛋白质研究，基础医学和临床 医学的研究。

Ø 目的蛋白的表达特性分析 Ø 目的蛋白与其它蛋白的互作 Ø 目的蛋白的组织定位 Ø 目的蛋白的半定量分析 实验操作 Western blot 转膜 免疫反应 显色或发光 蛋白定量 SDS-PAGE 蛋白提取 封闭 实验操作 Western blot 步骤一、蛋白提取 Ø WB过程中最重要的一点就是确定 目的蛋白在组织 、细胞中的定位， 选择 合适的提取方法把目的蛋白提 取出来才能进行后续的实验 Ø 防止蛋白质质的降解 • 冰上操作 • 加入蛋白酶抑制剂 • Bac-细菌蛋白抽提试剂 • Mam-哺乳动物蛋白抽提试剂 • Yea-酵母蛋白抽提试剂 • Tis-组织蛋白抽提试剂 • Nc-细胞核/浆蛋白抽提试剂 实验操作 Western blot 步骤二、蛋白定量 实验操作 Western blot 步骤三、SDS-PAGE E •SDS 是一种离子性的表面活性剂,它有强离子性的硫 酸根离子也带有疏水性的长碳链 •当 SDS 与蛋白质混合时，它会以其碳链与蛋白质的 疏水性氨基酸结合将蛋白质包起来,而以磺酸根离子 外露与水分子作用大多数蛋白质和 SDS 的平均结 合量是 1:1.4 (以重量为单位)，而蛋白质结合固定比 例的SDS 后 ，由于 SDS 带强负电荷，使蛋白质原先 所带电荷显得微不足道,且每单位重量的蛋白质所带 电荷一致 ，所以不同蛋白质的迁移率大小就主要由 蛋白分子大小这一主要因素决定。

实验操作 Western blot 步骤三、SDS-PAGE 凝胶浓度与蛋白分离范围 凝胶浓度（％ ） 线性分离范围 （KD) 1512-43 1016-68 7.536-94 5.057-212 Staking gel Separating gel 实验操作 Western blot 步骤四、转膜 • 膜的选择选择 ： NC、PVDF、尼龙膜 • 转转膜方法： 半干转、湿转 • 转转膜确认认： 立春红染色、蛋白预染Marker 实验操作 Western blot 步骤四、转膜 实验操作 Western blot 步骤四、转膜 p 半干转 • 用滤纸吸Buffer来做转移体系的转移方法； • 适合转移小分子量的蛋白； • 半干转的电流大小是按照面积来算的，时间是根据 蛋白分子大小定的； • 56mA/膜 1h p 湿转 • 将膜、胶、滤纸整个浸泡在Buffer的Tank里转移的 方法； • 适合转移大分子量（100KD以上）蛋白； • 湿转电流是恒定的，时间也是根据分子量而定； • 300mA 1h 实验操作 Western blot 步骤四、转膜 u丽春红 • 可逆染色，检测转膜效率。

• 与下游WB检测完全兼容，无任何干扰 u蛋白预染Marker • 实时监测 • 分子量参照 • 与目的蛋白同时转移至印迹膜上，检测 转膜效率 u对转膜后的凝胶进行考染 转膜确认 实验操作 Western blot 步骤五、封闭 为防止一抗或/和二抗与膜的非特异性结合产生的高背 景，因此需要进行膜的封闭，去除非特异结合位点 常用的封闭液： Blocking Buffer ：3% BSA 5% Milk Room Temperature 1 h 实验操作 Western blot 步骤六、抗体孵育 一抗选择： ü 单克隆抗体 或者 多克隆抗体 ü 直接标记的抗体 或者 未标记的抗体 ü 抗体所检测的种属：人、小鼠、大鼠等 注意：抗体的稀释倍数是由底物和待检测蛋白质的丰度决定的， 为了获得最佳实验结果，强烈推荐进行预实验，以确定具体的实验参数. 实验操作 Western blot 步骤六、抗体孵育 二抗的选择： 抗小鼠抗兔抗大鼠抗人抗山羊抗鸡抗豚鼠抗马 标记物HRP、AP、Biotin、荧光标记、无标记 荧光标记抗体 红色 Cy3、TRITC、RRX、Tex。