人参皂苷Rg1对6-OHDA所致MES23.5神经细胞损伤的保护作用.doc

1人参皂苷 Rg1 对 6-OHDA 所致 MES23.5 神 经细胞损伤的保护作用作者：王明波 陈文芳 谢俊霞 【摘要】 目的 探讨人参皂苷 Rg1 对 6-羟基多巴胺(6-OHDA) 所致 MES23.5 神经细胞损伤的保护作用方法 MES23.5 细胞常规培养，观察人参皂苷 Rg1 预处理对 6-OHDA 毒性作用的影响，MTT 法观察细胞存活率，实时荧光半定量反转录聚合酶链反应(real time RT-PCR)观察酪氨酸羟化酶（TH）和 Bcl-2 基因的表达情况结果 6-OHDA 可剂量依赖性地损伤 MES23.5 细胞(F=71.24,P0.01)，人参皂苷Rg1 预处理可对抗 6-OHDA 的毒性作用(F=14.63，P0.01)；6-OHDA 可明显降低 TH 和 Bcl-2 基因的表达，人参皂苷 Rg1 预处理可明显逆转上述改变(F=9.80、15.34，P0.01)结论 人参皂苷 Rg1 可明显对抗 6-OHDA 对 MES23.5神经细胞的损伤，其作用机制可能与抗凋亡有关 【关键词】 人参皂甙类；羟基多巴胺类；神经元；细胞保护 ［ABSTRACT］ Objective To study the protective effect of ginsenoside Rg1 against 6-OHDA-induced neurotoxicity in MES23.5 cells. Methods MES23.5 cells were routinely cultured and pretreated with ginsenoside Rg1 to determine the protective effect of Rg1 against 6-OHDA-induced neurotoxicity. The cell viability was observed by MTT method. The gene expressions of TH and Bcl-2 were detected by real time RT-PCR method. Results 6-OHDA induced cell death in a dose-dependent manner. Pretreatment with ginsenoside Rg1 had neuroprotective effects on cell viability against 6-OHDA-induced toxicity. 6-OHDA decreased the gene expressions of TH and Bcl-2. These effects could be reversed by Rg1 pretreatment. Conclusion Ginsenoside Rg1 has neuroprotective effects against 6-OHDA-induced neurotoxicity in MES23.5 cells, its mechansim may be related to its anti-apoptosis effects. ［KEY WORDS］ Ginsenosides; Hydroxydopamines; Neurons; Cytoprotection 帕金森病（PD）是一种常见的中老年人中枢神经系统慢性退行性疾病，其主要病理改变是中脑黑质致密带（SNzc）多巴胺（DA）能神经元进行性变性，引起黑质2（SN）-纹状体（Str）通路 DA 水平降低［1,2］。

PD 的病因迄今未明，发病机制十分复杂，研究认为其可能与氧化应激、兴奋性毒素、线粒体功能障碍、细胞凋亡机制等密切相关目前对于 PD 尚缺乏有效的治疗方法，因此从不同的角度入手，探寻新的治疗方法是当前研究的热点人参皂苷 Rg1 属于人参三醇类物质，是人参皂苷主要的活性成分之一大量研究揭示，人参皂苷 Rg1 具有多种生物活性［3,4］，特别是在中枢神经系统，有抗衰老、抗氧化、益智及保护神经元免受毒性物质的损伤等作用但人参皂苷 Rg1 对 DA 能神经元 MES23.5 细胞是否具有保护作用，目前尚未见报道本实验应用 6-OHDA 损伤 MES23.5 神经细胞，建立 PD 的细胞模型，研究人参皂苷 Rg1 的神经保护作用，以期为 PD 的防治提供进一步的实验依据 1 材料与方法 1.1 材料及其来源 人参皂苷 Rg1 购自白求恩医科大学，其纯度为 99.9%；DMEM/Ｆ12 培养基购自Invitrogen 公司（美国）；逆转录试剂盒购自 Promega 公司（美国）；SYBR Green 染料购自 Bio Rad 公司（美国）；噻唑蓝（MTT）和胎牛血清均购自 Gibco BRL 公司，其余均为 AR 级。

MES23.5 细胞由乐卫东教授提供（美国贝勒医学院） 1.2 细胞培养及药物处理 MES23.5 细胞接种于 96 孔板或 6 孔板，用含体积分数 0.05 牛血清及 Sato 成分的 DMEM/F12 培养基，于 37 ℃、体积分数 0.05 CO2 条件下培养细胞汇合达80%~90%时，用 6-OHDA 处理细胞 24 或 48 h，或 Rg1 预处理细胞 24 h 后，再用6-OHDA 处理 24 或 48 h，分为对照组（A 组）、6-OHDA 组（B 组）、Rg1+6-OHDA组（C 组） 1.3 MTT 法检测细胞生长 将传代细胞接种于 96 孔板中，每孔细胞数量为 3×103 个当细胞均匀贴壁生长时，用不同浓度 6-OHDA 处理细胞 48 h，或先用 10-8 mol/L Rg1 预保护细胞 24 3h，再用 6-OHDA 处理，48 h 后去除培养液，加 5 g/L 的 MTT 20 μL，于 37 ℃、体积分数 0.05 CO2 培养箱中继续培养 4 h，每孔加 DMSO 100 μL，混匀后用酶标仪检测 570 nm 处的吸光度(A)值计算细胞存活率［5］ 1.4 实时荧光半定量反转录聚合酶链反应(real time RT-PCR)检测酪氨酸羟化酶（TH）和 Bcl-2 基因的表达 将传代细胞接种于 6 孔板中，用 10-8 mol/L Rg1 预保护细胞 24 h，然后再用 6-OHDA 处理细胞 24 h，Trizol 法从细胞中提取总 RNA，取 1 μg 总 RNA 进行逆转录。

采用 SYBR green 染料法相对定量检测 TH、Bcl-2 和 GAPDH 的基因表达TH上游引物序列为 5′-AAAATCCACCACTTAGAG-ACC-3′；下游引物为 5′-TAGCCACAGTACCGTTCC-3′Bcl-2 上游引物序列为 5′-CCTGTGGATGACTGAGTACC-3′；下游引物为 5′-CCCACTCGTAGCCCCTCT-3′GAPDH 上游引物序列为 5′-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3′；下游引物为5′-CCCTGTTGCTGTAGCCGTAT-3′用未处理的样本做标准曲线，计算出靶基因的含量，并与内参基因 GAPDH 相比 1.5 统计学分析 数据以 x±s 表示，应用 SPSS 10.0 统计软件进行单因素方差分析（One-Way ANOV） 2 结 果 2.1 不同浓度 6-OHDA 对 MES23.5 细胞的毒性作用及 Rg1 的保护作用 MES23.5 细胞经 0、1、10、25、50、75、100、200 及 400 μmol/L 的 6-OHDA 处理 48 h，细胞的存活率分别为1.000±0.143、0.985±0.070、0.927±0.048、0.820±0.068、0.785±0.054、0.763±0.052、0.678±0.048、0.601±0.030 及 0.234±0.039。

6-OHDA 可剂量依赖性地降低 MES23.5细胞的生存率（F=71.24，P0.01）应用 10-8 mol/L Rg1 预处理细胞 24 h，可明4显降低 100 μmol/L 6-OHDA 的毒性作用（F=14.63,P0.01）见表 1 2.2 Rg1 对 6-OHDA 诱导的 TH 基因表达的影响 100 μmol/L 6-OHDA 处理细胞 24 h 可明显降低 TH 基因的表达，应用人参皂苷Rg1 预处理 24 h 后，可明显增加 TH 基因的表达，差异有高度显著性(F=9.80,P0.01)见表 1 2.3 Rg1 对 6-OHDA 诱导 Bcl-2 基因表达的影响 100 μmol/L 6-OHDA 可明显降低 Bcl-2 基因的表达，而人参皂苷 Rg1 预处理组Bcl-2 基因的表达较 6-OHDA 组明显增强(F=15.34,P0.01)见表 1 表 1 Rg1 预处理对 6-OHDA 诱导的 MES23.5 细胞存活率、TH 和 Bcl-2 基因表达的影响 3 讨 论 PD 是一种常见的中枢神经系统退行性疾病，主要病理改变是 SNzc DA 能神经元进行性变性缺失。

6-OHDA 是公认的可以诱发 DA 能神经元变性的神经毒素，可以直接抑制线粒体电子传递链复合物，导致 ATP 耗竭细胞变性死亡；也可通过单胺氧化酶 B 生成过氧化氢，再由 Fe2+经 Fenton 反应生成羟自由基，造成 DA能神经元变性、凋亡［6］本研究应用 6-OHDA 损伤细胞 MES23.5 这一 DA 能神经元细胞系，研究人参皂苷 Rg1 的神经保护作用及其机制MES23.5 细胞是一种杂交瘤性 DA 能神经元细胞系,由大鼠胚胎中脑细胞与小鼠神经母细胞瘤-胶质瘤细胞系 N18TG2 杂交而成，可替代原代培养的 DA 能神经元用于研究神经变性疾病 PD［7］ 人参是我国传统名贵中药，具有广泛的药理作用人参皂苷是人参的主要有效成分之一，可分三类：二醇型、三醇型、齐墩果酸型Rg1 属于三醇型人参皂苷，在人参皂苷中的含量丰富药理学研究表明，Rg1 具有抗衰老、抗氧化、提高免疫力和增强记忆力等作用 本研究结果显示，6-OHDA 可剂量依赖性降低细胞的生存5率，降低 DA 能神经元 TH 基因的表达，提示 6-OHDA 对 MES23.5 细胞具有毒性作用应用 Rg1 预处理后，上述指标有明显改善，提示 Rg1 对 MES23.5 细胞有保护作用，可对抗 6-OHDA 的毒性作用。

Bcl-2 是一种凋亡抑制蛋白，粒体参与的凋亡途径中起调控作用［8］本研究显示，6-OHDA 可以引起 Bcl-2 基因表达的降低，表明 6-OHDA 促进 MES 23.5 细胞凋亡作用而人参皂苷 Rg1 预处理后，Bcl-2 基因的表达可明显升高有研究表明，Bcl-2 基因的编码区含有雌激素反应元件，我们的前期实验证实，人参皂苷Rg1 可以通过激活雌激素反应元件，发挥类雌激素样作用［9］人参皂苷 Rg1 对 6-OHDA 诱导的 MES23.5 细胞凋亡的保护作用，可能与其类雌激素样特性有关 综上所述，本研究首次揭示人参皂苷 Rg1 可明显对抗 6-OHDA 对 MES23.5 细胞的毒性作用，其作用机制可能与抗凋亡有关 【参考文献】 ［1］DAWSON T M, DAWSON V L. Molecular pathways of neurodegeneration in Parkinson’s disease［J］. Science, 2003,302(5646):819-822. ［2］HAOBAM R, SINDHU K M, CHANDRA G, et al. Swim-test as a function of moto impairment in MPTP model of Parkinson’s disease: a comparative study 。