9AKP活性检测20日v.ppt

Q&A 关于噬菌体污染处理：1、环境用漂白粉灭菌； 2、用消毒液浸泡相关器具；3、菌种室甲醛熏消一夜；4、福尔马林溶液浸泡；5、更换或交替使用发酵剂；6、采用抗性菌株；特征：1、培养液变澄清；2、养份没有被正常消耗；3、噬菌斑：菌液涂板后出现溶菌透明圈，即噬菌斑；污染原因：菌体自带噬菌体 (特别是溶源性细菌); 环境中存在；表达产物AKP蛋白的检测 基因的克隆与表达专题之八基因的克隆与表达专题之八AKP,大肠杆菌碱性磷酸酶 (大肠杆菌碱性磷酸酯酶，EC.3.1.3.1) 在碱性环境下:水解多种磷酸单酯化合物需要镁和锰离子为激活剂关于关于AKP AKP (E.coli alkaline phosphatase）蛋白检测指标蛋白检测指标1 1、质、质活活 性性分子量分子量定定 性性结结 构构2 2、量、量表达产率表达产率获得产量获得产量蛋白浓度蛋白浓度纯纯 度度根据蛋白的特性根据蛋白的特性WesternWestern，测序等，测序等电泳，分子筛，沉降系数等电泳，分子筛，沉降系数等光光/ /色谱，晶体衍射等色谱，晶体衍射等分光，分光， 凯氏定氮等凯氏定氮等电泳，沉降、晶体衍射等电泳，沉降、晶体衍射等1 1、酶活测定：底物显色法、酶活测定：底物显色法AKPAKP405nm有特征吸收本实验410nm测定OD值pNPP（对硝基酚磷酸）无色PipNP （对硝基酚）黄色Na3PO4比尔-朗伯定律：OD = LC pNP=17500L mol-1 cm-1 C:光吸收物质的浓度（molL-1） L:光路长度（cm）1 1、酶活测定：底物显色法、酶活测定：底物显色法（其中n为稀释倍数）酶活力单位数 注:通过调整稀释倍数控制OD410在0.10.8之间30反应10min加入3.6ml终止液终止反应于410nm处测定吸光值40L酶液360L测活液+实验操作1. 菌体加入15mL匀浆液2. 超声破碎： 输出功率1200w，超声2秒， 间隔10秒，超声次数：40次3. 粗匀浆制样： 细胞破碎液 200uL 4x 样品处理液100uL + 匀浆缓冲液100uL 90变性5min，室温保存准备SDS电泳用。

取1ml粗匀浆置于冰上，准备测活4. 匀浆上清制备：另取1.0 mL细胞破碎液，4, 12000rpm10min离心，留上清液5. 上清液制样：匀浆上清 200uL 4x 样品处理液100uL + 匀浆缓冲液100uL ，90变性5min，室温保存准备SDS电泳用 余下的上清置于冰上，准备测活一、细胞破碎与制样一、细胞破碎与制样组别空白零对照空载体表达阴性对照(蓝斑)pETBlue-AKP阳性对照AKP表达粗匀浆上清粗匀浆上清匀浆浆液（uL）4000000粗匀浆浆（uL）040400400离心上清（uL）00040040测测活液（uL）360360360360360360室温反应应10min终终止液（mL）3.63.63.63.63.63.6OD410酶的活力二、二、AKPAKP酶活性分析酶活性分析丙烯酰胺甲叉丙烯酰胺TEMED (加速剂)APS (过硫酸铵,催化剂)聚丙烯酰胺凝胶2 2、分子量测定：、分子量测定：SDS-PAGSDS-PAG电泳电泳T分离范围（KD). T：丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺的总浓度 -改变T值改变胶孔径一般按a:b = 29:1 或a:b = 29.2 ：0.8配制储液a：丙烯酰胺的量 b：甲叉丙烯酰胺m：溶液的总体积C：表示交联剂所占百分比a+bT =m * 100% C b a+b * 100% =SDS-PAGE SDS-PAGE 的的 浓浓 缩缩 效效 应应电泳体系为不连续体系 电泳缓冲液与凝胶中的缓冲液不同 凝胶也由PH、凝胶孔径均不相同的两层胶组成Cl的快速泳动在其后面形成低电导，高电压梯度区带动Pr和Gly快速泳动，这样在高电压与低电压区形成界面，Pr浓缩成狭小薄层电荷效应、凝胶的分子筛效应Tris-Gly pH 8.3Tris-Gly pH 8.3浓缩胶 pH 6.8分离胶 pH 8.8Gly 、 Pr 、Cl样品浓缩后的样品SDS-PAGESDS-PAGE的变性作用的变性作用w SDS在溶液中能破坏蛋白质分子内和分子间的非共价键w 巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT)的作用使蛋白质分子中的二硫键打开 二者的作用使蛋白质变成单亚基并结合上SDS形成蛋白质SDS复合物w 由于SDS带有大量的负电荷，掩盖了蛋白质原有的电荷w SDS与蛋白质的结合，改变了蛋白质原有的构象，变成了近似于长椭圆棒，其短轴长度一样，而长轴与分子量大小成正比 SDS-PAGESDS-PAGE中，中，SDSSDS蛋白复合物的迁移率不再受蛋白的电荷蛋白复合物的迁移率不再受蛋白的电荷和形状的影响，而只与蛋白质的分子量正相关和形状的影响，而只与蛋白质的分子量正相关空载体离心后离心前MKd 9766453614实验操作1. 洗净胶板，架好和固定好胶板2. 配置12%分离胶（20mL）3. 分离胶混匀后用5mL枪头加入两玻 璃夹缝中，并小心在胶面上加入 1cm蒸馏水，约2040min后胶自然凝聚4. 倾斜倒出蒸馏水，配制5%浓缩胶（10mL）5. 浓缩胶混匀后加入两玻璃夹缝6. 在两玻璃板夹缝中垂直插入1.5mm的梳子，浓缩胶凝固后将凝胶装 入电泳槽，在槽中加入1SDS电极缓冲溶液，小心拔出梳子三、三、 AKP AKP的的SDSSDSPAGEPAGE电泳电泳7. 电泳加样： 将样品12,000r/min 室温离心10min后， 按顺序向胶孔中加入适当体积的蛋白样品（2030uL）和标准样品（10uL）8. 电泳：接通电源，电压设定为80V开始电泳，当样品进入分离胶时，调节电压使其恒定在120V,当溴酚蓝移动到离底部时，切断电源，停止电泳9. 将胶板从电泳槽中取出，小心从玻璃板上取下凝胶，将凝胶切成两部分10. 含蛋白标准的凝胶部分用R250染色、脱色和观察结果3 3、蛋白定性：、蛋白定性：Western BlottingWestern BlottingP1:凝胶电泳P2:转膜(印记）P3:封闭P4:结合一抗P5:结合酶标二抗P6:显色半干式转移装置 滤纸凝胶NC膜实验操作1. 另一部分凝胶、滤纸和硝酸纤维素膜分别在转移缓冲液中浸泡至少30分钟2. 正极上铺三层和凝胶一样大小的滤纸，然后依次将硝酸纤维素（NC）膜和凝胶铺在滤纸上，再在凝胶上铺三层滤纸，吸干“三明治”样结构周围的印迹缓冲液，并压另一极上（注意不要有气泡）3. 恒流1.0mA/cm2，电转移1.5hr4. 转移结束后将NC膜取出，用保鲜膜封好，40C存放，凝胶继续用R250染色以便分析转移的完全程度四、免疫分析四、免疫分析5. 到去封闭液，加入1xPBS稀释的一抗（稀释的倍数为ELISA所测效价的1/10），加入的一抗工作液覆盖住膜即可。

370C轻轻摇动，孵育45min6. 1xPBS清洗3次后(每次漂洗5min)，加入按 1：500倍稀释的偶联有辣根过氧化物酶的二抗370C轻轻摇动，孵育45min7. 1xPBS清洗3次(每次漂洗5min)，用显色液显色至出现清晰条带，加水冲洗终止显色反应。