弓形虫致BALBc小鼠卵细胞和胚胎的毒性作用.pdf

山西医科大学硕士学位论文弓形虫致BALB/c小鼠卵细胞和胚胎的毒性作用姓名：赵云鹤申请学位级别：硕士专业：病原生物学指导教师：侯玉英20060603山西医抖大学硕士拳位论文弓形虫致B A L B ／c 小鼠卵细胞和胚胎的毒性作用 摘要目的：本实验采用弓形虫感染B A L B ／c 雌鼠，①观察染虫雌鼠的毒性反应，建立生殖毒性的小鼠模型；②染虫雌鼠排卵情况及卵母细胞染色体的变化；③染虫雌鼠性激素( F S H 、L H 、E 2 ) 水平的变化；④着床前受精卵的发育情况；⑤孕中期鼠染虫后胚胎的发育情况，探讨弓形虫对雌鼠生殖功能及胚胎发育的毒性作用方法：( 1 ) 建立生殖毒性的小鼠模型：将B A L B ／c 雌鼠( 2 1 + 0 ．5 9 ，9 ．1 0 周) 随机分为1 1 组，每组1 0 只：A 组正常对照组( P B S ) 、染虫B 组( 腹腔注射经胰酶消化后的弓形虫速殖子2 5个／只／2 组、5 0 个／只／3 组、1 0 0 个／只／4 组、2 0 0 个／只／5 组、4 0 0 个／只／6 组) 和染虫C 组( 腹腔注射不经胰酶消化的弓形虫速殖子，设剂量、组数相同) 观察小鼠生存情况( 2 0 天) 。

2 ) 观察弓形虫对卵母细胞的影响：将B A L B ／c 处女鼠随机分为：正常对照1 组( P B S ) ，染虫组( 腹腔注射纯化的弓形虫速殖子：2 5 个／只，2 组、5 0 个／只／3 组、1 0 0 个／只／4 组、2 0 0 个／P , ／5 组) ，每组1 0 只；染虫3 天后超排，取卵母细胞计数、观察其染色体 3 ) 观察弓形虫对雌鼠性激素分泌的影响：设正常对照组( P B S ) 和染虫组( 腹腔注射纯化的弓形虫速殖子2 0 0 个／只) ，染虫6 天后，摘眼球取血，分离血清，用放免法测定雌鼠在一个动情周期中F S H 、L H 的水平；并测定雌鼠妊娠前3 天E 2 的水平 4 ) 观察弓形虫对受精卵发育的影响：将B A L B ／c 鼠随机分为正常对照组( P B S ) 和染虫组( 腹腔注射纯化的弓形虫速殖子：2 5 个／只／2 组、5 0 个／只／3 组、1 0 0 个／只／4 组、2 0 0 个／R ／5 组) ，3 天后超排、合笼、交配，次晨查阴栓，取各组受精鼠，再随机分3 组，每组1 0只观察妊娠前3 天的受精卵、2 ．细胞胚、4 ．细胞胚、桑椹胚及未受精卵、1 ．细胞胚、延迟胚，退化胚的数量、比率，并取小鼠主要脏器作病理切片，观察其病理学变化。

5 ) 观察弓形虫感染孕中期B A L B ／c 鼠的胚胎毒性：将受精鼠随机分为阴性对照组( P B S ，l 组) 、染虫组( 2 ～5 组) 和环磷酰胺组( 6 组) ，每组1 0 只，孕8 天染虫( 2 5 个／只／2组、5 0 个／只／3 组、1 0 0 个／只／4 组、2 0 0 个／只／5 组) ，孕1 8 天颈椎脱臼处死孕鼠，称雌鼠子宫、胎盘、胎鼠重量观察胎鼠有无吸收胎、死胎，并计数，取出活胎，肉眼观察其外观、内脏、骨髂有无畸形结果：( 1 ) 胰酶消化组的生存天数显著高于未消化组( P O ．0 5 ) ，5 组与正常组比较有显著性差异( P O ．0 5 ) ，第2 ～4 天峰值明显下降( P 0 ．0 5 ) 4 ) 染虫组4 8 —5 2 h 、7 6 ．8 0 h 、9 6 ．1 0 2 h 检出的胚胎总数均低于正常组( P 0 ．0 5 ) 5 0 个／只对母鼠胎盘重、胎鼠重有影响( P 0 ．0 5 ) ．T h ef o u r t hs e c o n d ：U s es t a t i s t i cs o f t w a r eS P S S13 ．0 ，t h ei n f e c t e dg r o u p4 8 ·5 2 h ，7 6 - 8 0 h ，9 6 ·1 0 2 he m b r y ot o t a lc o u n t sw e r el o w e rt h a nr e s p e c t i v en o r m a lc o n t r o lg r o u p s ( P O ．0 5 ) ，t h e5 0g r o u ph a v et h ee f f e c to ne m b r y om i c eb o d y 俨 O ．0 5 ) ；2 、3 、4 、5 各剂量组间均有差异( P 0 ．0 5 ) ，且平均存活天数均少于9 天。

因此，选用染虫B 组( 2 5个／只、5 0 个／只、1 0 0 个／只、2 0 0 个／只) 的剂量较为合适，但4 0 0 个／只剂量与染虫c 组对小鼠毒性较大，说明弓形虫速殖子感染B A L B ／e 雌性小鼠具有毒性作用在实验观察中发现胰酶消化组的生存天数显著高于未经胰酶消化组( P O ．0 5 ) ，3 组、4 组、5 组回收的卵母细胞总数与正常对照组明显减少( P O ．0 5 ) ，3 组( 5 0个／只) 、4 组( 1 0 0 个／只) 、5 组( 2 0 0 个／只) 回收卵细胞总数与正常对照组相比明显减少^98Hv船嚣寄“蘸山西医科大学葡士学位论文此，在染色体畸变方面有待于进一步探讨实验3 观察弓形虫对瑚虬B ，c 雌性小鼠性激素分泌的影响1 、材料和方法1 ．1 实验动物及虫株：B A L B ／c 雌鼠，清洁级，2 1 士0 ．5 9 ，引自中国疾病预防控制中心实验动物研究所，本室饲养繁殖，保持近交弓形虫R H 株，引自北京大学医学部寄生虫学教研室，本室液氮保存，常规复苏，无菌接种B A L B ／c 小鼠，转种三代，收集腹水，胰酶消化、洗涤、纯化、计数1 _ 2 主要试剂及仪器：人促卵泡生成激素( F S H ) 放射免疫分析试剂盒：产品批号：2 0 0 6 0 2 2 9 ，北京北方生物技术研究所。

人促黄体生成激素( L H ) 放射免疫分析试剂盒：产品批号：2 0 0 6 0 2 2 9 ，北京北方生物技术研究所雌二醇( E 2 ) 放射免疫分析试剂盒：产品批号：2 0 0 6 0 2 2 8 ，北京北方生物技术研究所S N ．6 1 0 0 型全自动放射免疫Y 计数器：上海日环仪器厂1 ．3 实验方法：1 ．3 ．1 测雌性小鼠F S H 、L H 水平：( 1 ) 分组、染虫：选取9 ～1 0 周龄B A L B ／c 处女鼠( 2 1 士0 ．5 9 ) ，随机分8 组，每组6只：正常对照A 组( A lA 2 A 3 A 4 ) 和染虫B 组( B 1B 2B 3B 4 ) A 组腹腔注射无菌P B S ／0 ．2 m l ／只，B 组腹腔注射纯化的弓形虫速殖子2 0 0 个／0 ．2 m l ／只 2 ) 动情周期的观察p 3 】：染毒6 天后，观察动情周期( 1 ～4 天) 的出现，观察阴道，确定动情周期( e s t r u sd i a g n o s i s ) ：动情第1 天外阴苍白色，有少量粘液分泌；动情第2 天外阴粘膜呈淡红色且湿润有光泽，大量透明稀薄粘液排出；动情第3 天外阴呈紫红色而光泽减退，粘液量少而稠，有时用小镊子可拉长成丝状，阴道粘膜上皮细胞脱落；动情第4天又称休情期，无阴道粘液分泌。

3 ) 分离血清：在动情周期每一天的实验鼠，摘眼球取血，静置l h ，离心2 0 0 0 r p r r d m i n ，2 0 m i n ，3 7 C 温箱中孵育2 h ，用移液枪移取血清，置1 ．5 m lE p p e n d o r f 管，一2 0 ℃冰箱内保存，待用 4 ) 放免法测定F S H 、L H 含量：按照由北京北方生物制品研究所提供的放射免疫测定试剂盒操作规程进行操作，所有样品同批测定，以避免批次误差 D F S H 测定：药盒组成：1 2 5 I - F S H1 瓶( 溶液) 、F S H 抗体1 瓶( 溶液) 、F S H 标准品7 瓶，浓度为：0 、2 ．5 、5 ．0 、1 0 、2 0 、4 0 、1 0 0 M i u ／m l 、分离剂( 第二抗体) 1 瓶测定方法：按以下程序操作山西匿辩丈学碡士学位论文分率，在半对数坐标纸上绘制标准曲线，并查出样品值1 ．3 ．2 测雌性小鼠E 2 水平：( 1 ) 选取9 ～1 0 周龄健康B A L B ／c 处女鼠( 2 1 士0 ．5 9 ) 随机分为6 组：正常对照A 组( A IA 2A 3 ) 和感染B 组( B lB 2B 3 ) ，A 组腹腔注射无菌P B S ／0 ．2 m l ／只，B 组腹腔注射纯化的弓形虫速殖子2 0 0 个／0 ．2 m l ／只。

染毒3 天，与健康雄鼠1 ：1 合笼、交配，次晨查阴栓，查到者记为妊娠0 天，未查到的弃去 2 ) 分离血清：分别在妊娠1 、2 、3 天摘眼球取血，静置1 h ，离心2 0 0 0 r ／m i n ，2 0 m i n ，3 7 C 温箱中孵育2 h ，用移液枪移取血清，置1 ．5 m lE p p e n d o r f 管，- - 2 0 C 冰箱内保存，待用 3 ) 放免法测定E 2 含量：按照北京北方生物制品研究所提供的放射免疫测定试剂盒操作规程进行操作，所有样品同批测定，以避免批次误差药盒组成：”5 I ．E 2溶液1 瓶、E 2 抗体溶液1 瓶、E 2 标准品溶液7 瓶，浓度分别为：0 、1 0 、5 0 、1 0 0 、2 5 0 、7 5 0 、2 0 0 0 p g ／m l 、免疫分离剂( 第二抗体) 1 瓶测定方法：按以下程序操作E 2 R L A 操作程序( 单位：m )结果计算：以N ／T 、B ／T 计算N S B 、S o 结合百分率，以B ／B o 计算标准及待测物结合百分率，在半对数坐标纸上绘制标准曲线，并查出样品值3 ．3 数据处理：数据用x ：k s 表示，采用S P S S l 3 ．0 统计软件，单因素方差分析：同组小鼠不同时段激素含量的差异，S N K 法比较相同时段激素含量的组问差异。

2 实验结果：表3 - 1 、表3 ．2 、表3 - 3 ；附图2 0 ，2 6 - 2 8 山西医辩大学焉士学位论文表3 - 1弓形虫染毒后雌鼠F S H 水平的变化( 夏±s )组别第一天第二天第三天第四天n q i ，壕示与阴性对照组相比，／K 0 ．0 5日形虫感染后R “水平变化动情周期( 天)图表2 ：n = 6 ，+ 示与阴性对照组相比，P o ．0 5 )观察动情周期第一天，感染组的F S H 、L H 水平与对照组无明显区别；动情第二天，激素分泌量明显减少( P O ．0 5 ) 3 、讨论：人体卵巢产生卵子是由卵巢皮质内卵泡经过初级卵泡、次级卵泡逐渐发育为成熟卵泡三个阶段卵泡是由一个卵母细胞和包绕在其周围的多个卵泡细胞组成，卵母细胞的成熟包括胞核成熟与胞浆成熟：胞核成熟的过程是在c d c 2 、c ．m o s 基因的调控下、在胞浆蛋白、促成熟因子( M P F ) 与细胞生长抑制因子( C S F ) 等参与下完成的：胞浆成熟则与卵丘细胞和颗粒细胞密切相关：卵丘细胞接受下丘脑．腺垂体分泌的F S H 的刺激，合成多种调控因子( 如雌激素受体、c ．m o s 与c —r a f m R N A 等) ，颗粒细胞在甲状腺素、三碘甲状腺氨酸与F S H 的山西医辩太学焉士学位论文协同作用下，刺激下丘脑一腺垂体分泌L H ，促使L H 受体增加和孕酮分泌；此外钙离子释放也参与了卵母细胞成熟的最后过程删。

因此卵子的成熟与排放是一个多因子参与、多步骤完成，形成下丘脑．垂体．性腺轴( H P O A ) 予富内膜周期的变化又受卵巢分泌的性激素调控；而且雌激素对下丘脑．腺垂体分泌活动进行正、负反馈调节在L H 作用下卵巢颗粒黄体细胞分泌孕激素，泡膜黄体细胞分泌雌。