第22章 免疫学检测原理及临床应用.ppt

医学免疫学医学免疫学第二十二章第二十二章 免疫学检测原理免疫学检测原理及临床应用及临床应用12 抗原抗体检测 免疫细胞检测 免疫分子检测第一节第一节 基于抗原基于抗原- -抗体反应的检测方法抗体反应的检测方法 用已知抗原检测未知抗体，诊断或辅助诊断疾病 用已知抗体检测未知抗原，鉴定病原体或辅助诊断疾病 定性或定量检测体内各种大分子物质，诊断或辅助诊断相关疾病 用已知抗体检测某些半抗原物质，监测血清中药物浓度或运动员违禁药品水平34一、抗原抗体结合一、抗原抗体结合 反应的特点反应的特点特异性和交叉反应 带现象与可见性 可逆性 二、抗原二、抗原- -抗体反应的影响因素抗体反应的影响因素电解质，酸碱度，温度抗原和抗体的性质、浓度、比例是决定因素 三、抗原抗体反应的基本检测方法三、抗原抗体反应的基本检测方法5（一）凝集反应（一）凝集反应(agglutination)(agglutination)6（二）沉淀反应（二）沉淀反应(precipitation)(precipitation) 单扩的原理双扩的原理单扩实验7双扩实验8免疫电泳9（三）补体参与的反应（三）补体参与的反应 溶血空斑试验（见后）溶血空斑试验（见后） 补体依赖细胞毒实验补体依赖细胞毒实验 补体结合试验10 （四）免疫标记技术（四）免疫标记技术1. 1. 免疫荧光技术免疫荧光技术112. 2. 酶免疫测定酶免疫测定(enzyme immunoassay, EIA)(enzyme immunoassay, EIA)酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA) 直接法12ELISA双抗体夹心法和间接法13ELISPOT14biotin avidin system(BAS)ELISA153. 3. 免疫组化技术免疫组化技术(immunohistochemistry (immunohistochemistry techenique) techenique) 4. 4. 放射免疫测定法放射免疫测定法(radioimmunoassay(radioimmunoassay，RIA) RIA) 5. 5. 胶体金标记技术胶体金标记技术6. 6. 化学发光免疫分析化学发光免疫分析7. 7. 免疫印迹法免疫印迹法 (immunoblot) (immunoblot) 16第二节第二节 免疫细胞检测免疫细胞检测（一）外周血单个核细胞（一）外周血单个核细胞(PBMC)(PBMC)的分离的分离一、免疫细胞及其亚群计数一、免疫细胞及其亚群计数17（二）淋巴细胞亚群的分离（二）淋巴细胞亚群的分离1. 1. 尼龙棉分离法尼龙棉分离法 2. E2. E花环分离法花环分离法 183. 3.洗洗淘淘法法194. 4. 流式细胞术流式细胞术(flow cytometry(flow cytometry，FCM)FCM)205. 5.磁磁分分离离技技术术21（三）淋巴细胞亚群计数（三）淋巴细胞亚群计数1. 1. 免疫荧光技术免疫荧光技术2. 2. 补体依赖微量细胞毒试验补体依赖微量细胞毒试验3. 3. 流式细胞术流式细胞术4. 4. 花环试验花环试验 22用用FITCFITC- -抗抗IgMIgM单抗计数单抗计数B B细胞细胞23二、淋巴细胞功能测定二、淋巴细胞功能测定（一）淋巴细胞功能测定的体外试验（一）淋巴细胞功能测定的体外试验 1. 1. 淋巴细胞增殖试验淋巴细胞增殖试验 刺激物刺激物 * * 非特异性：丝裂原PHA、Con A、LPS，抗CD3单抗，同种MHC等 * * 特异性：破伤风类毒素、PPD、白色念珠菌、肿瘤细胞等 方法：方法：核素掺入法、MTT法和形态学计数法24淋巴细胞增殖试验（淋巴细胞增殖试验（3 3H-TdRH-TdR掺入法）掺入法）252. 2. 细胞毒试验细胞毒试验CTL、NK细胞可直接杀伤靶细胞 5151CrCr释放法释放法 LDHLDH释放法释放法26 细胞凋亡检测细胞凋亡检测DNA LadderDNA Ladder电泳图谱电泳图谱27TUNELTUNEL法检测凋亡细胞法检测凋亡细胞28FCMFCM检测凋亡细胞检测凋亡细胞293. 3. 分泌功能测定分泌功能测定 细胞因子分泌细胞：细胞因子分泌细胞： ELISPOT 抗体形成抗体形成 细胞测定：细胞测定： 溶血空斑 试验（一）测定淋巴细胞功能的体内试验（一）测定淋巴细胞功能的体内试验 迟发型超敏反应皮肤试验 特异性特异性: : OT皮试、过敏原皮试 非特异性非特异性: : PHA 皮试、DNCB皮试第三节第三节 免疫分子检测免疫分子检测一、免疫球蛋白一、免疫球蛋白/ /抗体的测定抗体的测定免疫比浊、ELISA、RIA、免疫电泳等二、补体测定二、补体测定免疫比浊、ELISA、RIA、CH50 32三、细胞因子检测三、细胞因子检测1. 1. 免疫学测定法免疫学测定法 分泌性细胞因子检测：ELISA、RIA、WB 胞内细胞因子检测：FCM、ELISPOT2. 2. 生物活性测定法生物活性测定法 促进细胞增殖和增殖抑制法、抗病毒活性测定法、直接杀伤法、趋化活性测定法3. 3. 分子生物学测定法分子生物学测定法PCR、实时定量PCR、RNA印迹法、核酸酶保护分析法和原位杂交法等33四、四、CDCD分子、表面受体和黏附分子检测分子、表面受体和黏附分子检测 细胞表面分子：细胞表面分子：间接免疫荧光法、FCM等 可溶性分子：可溶性分子：ELISA等五、五、HLAHLA分型分型 方法：方法：血清学方法、细胞学方法、基因分型 应用：应用：同种移植供受者配型、法医鉴定、某些疾病研究等 34第四节第四节 免疫学诊断与检测免疫学诊断与检测35一、疾病相关因子检测一、疾病相关因子检测（一）用已知抗体检测未知抗原（一）用已知抗体检测未知抗原 病原体及其抗原组分：病原体及其抗原组分：属、型、血清型 肿瘤抗原的定性、分型、定量与定位：肿瘤抗原的定性、分型、定量与定位：AFP、CEA、体内示踪 红细胞血型抗原红细胞血型抗原（二）用已知抗原检测未知抗体（二）用已知抗原检测未知抗体 病原特异性抗体：病原特异性抗体：检测HIV抗体确定HIV感染 外斐氏试验检测立克次体抗体 肥达氏反应测伤寒杆菌抗体 变应原抗体：变应原抗体：体外用不同的变应原与患者血清反应确定变应原；体内用多种变应原进行皮试 自自身抗体：身抗体：组织切片，免疫荧光、免疫酶组化 细胞毒抗体：细胞毒抗体：待移植患者血清与供体细胞混合并加入补体（补体依赖细胞毒试验，交叉组织配型）36（一）体液免疫功能（一）体液免疫功能 免疫球蛋白：免疫球蛋白：免疫缺陷病、免疫增殖性疾病 抗体水平：抗体水平：检测某些针对疫苗或感染因子的抗体 B B细胞数量与功能：细胞数量与功能：原发或继发免疫缺陷（二）细胞免疫功能（二）细胞免疫功能 T T细胞总数与亚群：细胞总数与亚群：CD3、4、8、25，Th1、Th2 T T细胞功能：细胞功能：增殖反应（非特异、特异）、细胞毒、皮试（三）（三）细胞因子及其受体和粘附分子水平细胞因子及其受体和粘附分子水平（四）（四）非特异免疫功能非特异免疫功能 补体、NK细胞、巨噬细胞及其产物、中性粒细胞等37二、免疫功能检测二、免疫功能检测 感染性疾病转归和预后：乙肝、感染性疾病转归和预后：乙肝、AIDSAIDS等等 肿瘤发展、预后与疗效判断肿瘤发展、预后与疗效判断 移植排斥反应的预测、药物选择、疗效移植排斥反应的预测、药物选择、疗效评估评估38三、免疫学监测三、免疫学监测 抗原与抗体特异性结合，抗体又能与抗Ig特异性结合，这一关系被用于多种检测方法。

抗原抗体反应分为凝集反应和沉淀反应，免疫标记技术具有灵敏度高，能定性、定量等优点，应用广泛 免疫细胞具表面标志，利用抗体可鉴别不同细胞群及其数量；体外功能试验反映某一细胞群的功能，体内功能试验则反映整体免疫功能水平 免疫分子的检测可采用免疫学方法、生物活性测定法及分子生物学方法 了解上述基本原理后，可举一反三，根据需要选择或设计相应实验，用于基础和临床研究 小小 结结39思考题思考题 名词解释：indirect agglutinastion， ELISA， BAS，ELISPOT，double immunodiffusion， immunoblot（Western blot）， FCM，RIA 抗原抗体反应有哪些特点？哪些基本类型？最敏感和最不敏感的方法各是哪一类？ 可用哪些方法测定血清中Ig含量？其原理如何？ 有哪些免疫标记技术？它们之间有何主要不同？ 有哪些方法可检测T、B细胞的功能？细胞增殖试验和细胞毒性试验各有哪些基本方法？40。