津血源增加口干症模型鼠唾液分泌机制的实验研究.doc
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津血源增加口干症模型鼠唾液分泌机制的实验研究津血源增加口干症模型鼠唾液分泌机制的实验研究［摘耍］为分析津血源的具体作用机制，该实验对津血源增加 口干症模型SD大鼠唾液分泌与激动受体之间的关系进行了研究研 究通过使用M受体阻滞剂4-二苯乙酰氧基-N-甲基-哌噪（4-DAMP） 和阿托品，或肾上腺受体阻滞剂酚妥拉明，制作3组口十症模型大鼠; 造模成功后，予中药津血源灌胃，根据临床常用剂量及SD大鼠体表 面积换算，阿托品组将实验动物分为津血源低、中、高剂量组，4-DAMP 及酚妥拉明组灌胃中剂量津血源所有动物给药后，连续测定150 min 的唾液分泌量，观察津血源增加唾液分泌的作用特点及与受体之间的 关系；并分离大鼠的颌下腺组织，通过Western blot分析津血源对 颌下腺细胞水分子通道蛋白5 （AQP5）表达的影响结果发现，比较 各组唾液分泌量，与生理盐水组、酚妥拉明组、4-DAMP组及阿托品 组相比，津血源组的唾液分泌明显增加，并存在明显差异，P<0. 05o 在阿托品组中，津血源低剂量组与生理盐水组疗效相当，而津血源中 剂量组与生理盐水组相比，存在统计学差异（卩〈0.05）唾液分泌量 增加的时间曲线图中，发现津血源组与生理盐水组之间存在统计学差 异（P〈0.05）。
与各阻断剂组相比，津血源治疗组颌下腺细胞AQP5蛋 白量的表达较前增加，P<0.05；除阿托品组外，津血源对其余2组阻 断剂的疗效与生理盐水组无明显差异对津血源给药后的3种阻断剂 AQP5的表达量进行比较，发现津血源对阿托品组的疗效比4-DAMP、 酚妥拉明组史明显（P<0.05）,后两者之间并不存在统计学差异因 此，研究认为津血源增加唾液分泌（养阴生津作用）的机制可能是通 过毒蕈碱M受体（尤其是M3受体）、肾上腺素受体介导 的作用途径，增加唾液腺细胞膜AQP5的表达，促进唾液分泌［关键词］津血源；干燥综合征（SS）；唾液分泌；肾上腺素受体； 毒蕈碱M3受体；AQP5［收稿日期］2014-01-18［基金项目］国家自然科学基金项目(81273714)；江苏省自然科 学基金项目(BK2011870)［通信作者］钱先，教授，博士，主任医师，研究方向为风湿免 疫病的中西医临床研究,Tel: (025) 86617141-91905, E-mail： moneyfirstl@163・ com干燥综合征(Sjogrenz s syndrome, SS),又称口眼干燥综合症, 是一种常见的慢性炎症性的自身免疫疾病，主要累及外分泌腺体，临 床上主要表现为口眼干燥、皮肤干燥，常累及肺脏、肾脏等系统损害。
本病属中医“燥证”的范畴，症候表现以内燥为主，亦有外燥表现° 西医的治疗手段主要局限于免疫抑制剂、糖皮质激素及催涎剂，且易 出现毒副作用，而中医中药在治疗SS方面却发挥了良好的疗效津 血源颗粒是基于“津血同源”的中医理论而自制的江苏省中医院院 内制剂，具有滋阴养血润燥之效，主要用于SS等自身免疫疾病的干 燥症候，临床应用疗效达85%,长期应用无毒副作用，病人依从性良 好以往的临床研究［1-2］表明：津血源可明显改善患者的干燥症状 本课题组前期的动物实验研究［3-6］显示津血源能明显促进SS模型 鼠唾液分泌，仆1其具体机制尚未完全阐明水分子通道蛋白(AQPs) 是一系列含6个跨膜感受器的家族，像管道…样联系细胞的腔面和血 管面，起着水分运输的作用既往研究［7］报道，AQPs与唾液分泌相 关由AQPs转运的水分占唾液中水分总量的60%［8］,但目前只有AQP5 证实与SS患者唾液分泌密切相关本实验在前期研究的基础上，在口干症动物模型上明确津血源激 动受体的途径和作用特点，研究津血源对唾液腺细胞AQP5表达量的 影响，为后续研究津血源的生津作用涉及的信号传导通路提供实验基 础，为“津血同源”的中医传统理论提供系统依据o1材料1. 1动物 健康雄性SD大鼠(年龄7〜8周)，体重(200±10) g, 由中国医学科学院实验动物研究所提供。
1.2药物、试剂及耗材 津血源浸膏(每1 niL含原药1 g)：江 苏省中医院药厂生产，本研究采用成形前的稠膏，并按药典的标准与 要求进行检验和定性定量控制，具体药方组成生地黄、南沙参、麦冬、 鹿含草、口芍、乌梅、水牛角、土茯苓、丹参、威灵仙、薪蛇；乌拉 坦（化学名氨基甲酸乙酯C3H7N02） 500 g,购买于上海 青析化工科技有限公司；0.9%氯化钠注射液，购于南京小营药业集 团有限公司；毛果芸香碱滴眼液，购于永光制药有限公司；硫酸阿托 品注射液，购于上海禾丰制药有限公司；4-二苯乙酰氧基-N-甲基- 哌唳（4-DAMP）购于sigma公司;酚妥拉明购于扬州制药有限公司一抗：稀释1 000倍的抗AQP5多克隆抗体，Abeam ab78486o二 抗：羊抗兔-HRP； Protein Marker （江苏南京钟鼎生物自制）Acr, Bis, Tris （购自 Sigma 公司）；SDS （购自 Amresco 公司）；TEMED （购 自BI0-RAD公司）；其他试剂均为国产分析纯Allegra 21R台式高速冷冻离心机（美国BECKMAN公司）；台式 高速离心机（徳国SORVAL公司）；Gel Doc2000成像系统、垂直电泳 系统（美国 BIO-RAD 公司）；320-S pH 计（美国 Mettler Toledo 公 司）；AR5120电子天平（美国AH0MS公司）；MultiTempIII恒温水浴 锅；雪花状制冰机（H本SANYO公司）；超净工作台（中国苏净集团）； NANODROP2000 （Thermo 公司）。
2方法2.1 I I干症大鼠模型的制备与大鼠唾液分泌量的测量 利用乌拉 坦将所有动物腹腔麻醉（1. 3 g・kg-l）o设毛果芸香碱（选择性Ml受体激动药）为阳性对照，生理盐水为阴性 对照参照Yanagi Y等［9］方法，通过尾静脉给了下列药物（1 mg• kg-l）： M3受体阻滞剂 4-DAMP, M 受体阻 滞剂阿托品、a受体阻断药酚妥拉明，制备3组口干症模型造模 成功20 min后，实验遵循随机、重复和对照的原则根据津血源临 床常用剂量及SD大鼠体表面积换算，将阿托品组分为津血源高、中、 低剂量组；其余2种阻断剂组给予中剂量津血源所有动物给药后舌 下放置30 mg干棉球，测定大鼠的唾液分泌量，每只棉球每30 min 史换1次，连续测定150 min,通过称前后干棉球的重量差计算最大 唾液分泌量 2. 2Western Blot 检测 AQP5 毛果芸香碱(1 mg ・ kg-l)尾 静脉给药，作为AQP5水平表达的阳性对照组。
津血源灌胃30 min后， 脱颈处死大鼠，切开双侧颈部，取双侧下颌下腺腺体组织样品通过 RIPA裂解获得上清，每个样品分别上样80 ugo上样完毕后，聚丙 烯酰胺凝胶先90 V跑完积层胶，再将电压升至200 V直到电泳结束 电泳结束后，取下凝胶进行转膜，恒压100 V转膜，约为1.5 ho电 转结束后，取下膜后先用PBS洗涤4次，每次5 mino然后置于5% 脱脂奶粉封闭液中封闭37 °C 1 ho用封闭液稀释一抗，膜在一抗稀 释液中37 °C反应1 ho洗膜4次，每次5 min；用含5%牛奶的封闭 液稀释二抗膜在二抗中37 °C反应1 ho最后，洗膜ECL显影2. 3统计方法 结果用表达采用GraphPad software软 件，进行统计数据及检验统计方法用单因素方差分析或者非参秩和 检验，P<0. 05为2组之间存在统计学差异3结果3. 1津血源诱导模型鼠唾液分泌的观察给药阿托品(1 mg・ kg-l)建立模型鼠后，津血源灌胃，生理盐水为阴性对 照组,同等剂量(1 mg・kg-l)尾静脉注射，测量150 min 的唾液分泌量模型组与对照组之间存在明显差异，P<0. 05；而津血 源可增加模型鼠的唾液分泌，津血源0. 22 mL组与生理盐水组之间未 见明显差异，而津血源0. 5 mL组与对照组之间存在明显差异,P〈0・05, 见表lo对阿托品模型鼠给予牛:理盐水或中剂量津血源给药，即津血源 0. 5 mL (1.3 mg ・ kg-l)灌胃，生理盐水 1 mg ・ kg-l尾静脉注射，每30 min测定1次唾液分泌量，连续 测定150 min,观察两者在诱导模型大鼠唾液分泌方面有无差异，见 图1。
与生理盐水组比，存在统计学差异，P<0. 05o3.2津血源对各阻断剂抑制唾液分泌作用的影响肾上腺受体阻 滞剂酚妥拉明(1 mg・kg-l)静脉给药，大鼠唾液分泌 量受到抑制，与空口对照组有明显差异而津血源(1・3 mg・ kg-l)给药后，可缓解酚妥拉明引起的唾液抑制作用， 增加大鼠唾液的分泌，有统计学意义,见表2选择性M3受体阻滞剂4-DAMP,以1 mg • kg-l静脉给药大鼠的唾液分泌受到中度抑制，唾液分 泌较正常对照组显著减少而津血源(1. 3 mg・kg-l) 灌胃后测得的唾液分泌量，较正常对照组和4-DAMP组均有所增加 因此，津血源可恢复由4-DAMP引起的唾液分泌抑制作用，与对照组 和4-DAMP组相比，具有明显统计学差异M受体阻滞剂阿托品，以1 mg • kg-l静脉给药后， 唾液分泌被严重抑制，大鼠的唾液分泌量较正常对照组显著减少治 疗组给药津血源(1. 3 mg • kg-l)后,大鼠的唾液分泌 量得到恢复，并明显增加。
与对照组和阿托品组相比，具有统计学意 义因此津血源可缓解由阿托品介导的唾液分泌抑制比较津血源对3组模型组唾液分泌量的影响，并未发现津血源缓 解3组阻断剂阻断的唾液分泌量的作用强度存在统计学差异大鼠分别静脉给予酚妥拉明、4-DAMP及阿托品(1 mg・ kg-l),对照组不给任何药物20 min后中剂量津血源 灌胃给药每种药物给药后测量各组唾液分泌量与对照组及各阻断 剂组相比，阻断剂组+津血源组的唾液分泌得到增加，P<0. 05 o3.3津血源对颌下腺细胞AQP5蛋白表达的影响AQP5是相对分 子质量为27 kDa的蛋口质本研究发现AQP5蛋口在生理盐水组大鼠 的下颌下腺中有表达，毛果芸香碱亦能诱导及增加AQP5蛋口的表达, 与生理盐水组、模型组相比，P<0. 05o各阻断剂组的颌下腺细胞AQP5 的表达均较生理盐水组下降，P<0. 05o各组给药津血源后，AQP5的 表达量得到恢复，并较阻断剂组明显增加，以阿托品组表现最为明显, 存在统计学意义，P<0. 05o在阿托品组，津血源的疗效较阴性对照生 理盐水组明显，与毛果芸香碱组并不存在统计学差异；在4-DAMP组 和酚妥拉明组，津血源的作用与生理盐水相当，疗效不及毛果芸香碱 明显。
4讨论津血源颗粒主要由养阴药生地黄、北沙参、麦冬等和养血药口芍、 阿胶、丹参等组成，通过滋阴而改善体内阴液失衡，增加体内津液的 来源，促进口鼻等腺体的分泌；通过养血活血，增加津液转化敷布, 增强脏腑孔窍的濡润通过前期大量的临床研究及实验研究，津血源 促进唾液分泌的疗效得到肯定，但具体机制尚不明确本实验主要在 口干症动物模型上明确津血源激动受体的途径和作用特点唾液腺的分泌主要由交感和副。
