液相色谱提取维生素C.docx

微波辅助提取-高效液相色谱法测定蔬果中的 Vc 含量1微 波 辅 助 提 取 -高 效 液 相 色 谱 法 测 定 蔬 果 中 的 Vc 含 量摘要 本实验 以微波辅助提取法，用 1mol/L 的乙酸萃取 3 组质量分别为 5.0177g、5.0002g、5.0015g 的火龙果，猕猴桃，鸭梨样品中的 Vc，用高效液相色谱法进行定性和定量 分析通过对比保留时间进行定性分析，以标准曲线法进行定量分析配制系 Vc 列标准溶液，以峰面积对浓度作图绘制标准曲线，再测定样品的 峰面积，然后代入标准曲线方程，便可得出样品 Vc 浓度，进一步可算出 Vc 含量实验所得标准曲线方程为 y = 32600x -44230，相关系数为 R² =0.9971实验测得火龙果，猕猴桃，鸭梨的 Vc 含量分别为6.20mg/100g、31.12mg/100g、3.52mg/100g高效液相色谱法测定蔬果中维生素 C 含量，具有操作简单、分析速度快、灵敏度高、准确性高，试剂用量少等优点关 键 词 微 波 辅 助 提 取 法 高 效 液 相 色 谱 法 标 准 曲 线 法 维 生 素 C 含 量 1 引 言维生素 C 又称“抗坏血酸”，是人体健康所必需的 13 种维生素之一，能在体内各器官系统中发挥作用。

它既能促进受伤血管壁的愈合，又是合成体内软骨素的重要原料，软骨素则能消除血管壁上附着的胆固醇和脂肪的积存，对血管有保护作用它还能防治冠心病，预防消化道如食道、胃、直肠癌的发生人体所需的维生素 C，90 ％是从水果、蔬菜中获取的我们日常食用的蔬菜和水果中，有许多含有丰富的维生素 C[1]分析测定维生素 C 的方法有：2,6-二氯靛酚滴定法 [2]，因滴定终点较难掌握，容易影响测定结果的准确性；荧光光度法 [3]，具有高灵敏度、精确度高、受干扰少特点；近红外光谱法 [4]，简单高效，无需前处理且不消耗样品，但灵敏度，准确性较差；在近几年的 Vc 研究中使用较多的方法是高效液相色谱法 [5]方法专属性强、分离效果 好、分析速度快、灵敏度高、简便易行、结果准确可靠，更适于维生素 C 的测定本实验采用微波辅助法，用 1mol/L 的乙酸萃取 3 组质量分别为 5.3361g、5.3327g、5.3266g 的火龙果，猕猴桃，鸭梨中的 Vc，用高效液相色谱法进行分析测定通过对比保留时间进行定性分析，以标准曲线法进行定量分析由系列 Vc 标准溶液 绘制峰面积对浓度的标准曲线，通过测定样品的峰 面积，再由标准曲线得出样品 Vc 浓度，然后进一步计算样品 Vc 含量。

实验测得火龙果，猕猴桃，鸭梨的 Vc 的含量分别为 6.20mg/100g、31.12mg/100g 、3.52mg/100g高效液相色谱法测定蔬果中的维生素 C 含量，操作简单、分析速度快、灵敏度高、准确性高，试剂用量少 等优点2 实 验 部 分2.1 仪 器 与 试 剂2.1.1 仪 器高效液相色谱仪：LC-2010C（岛津香港有限公司） ；微波萃取仪（上海新仪微波化学科技有限公司） ；色谱柱：依微波辅助提取-高效液相色谱法测定蔬果中的 Vc 含量2利特或 PhenomenexC18 柱(250 mm×4.6 mm, I.D.5μm)；平头进样器2.1.2 试 剂乙腈（色谱纯） ，冰乙酸，维生素 C，磷酸二氢钾等均为分析纯；蔬果样品（火龙果，猕猴桃，鸭梨） 实验用水为超纯水Vc 标准溶液：快速准确称取 0.025gVc，用 1mol/L 乙酸溶液溶解，定量转移至 250 mL 容量瓶中，用 1mol/L 乙酸溶液定容，得到 100mg/L 标准溶液备用，现用现配本次实验事先准备，不需配制2.1.3 色 谱 条 件流动相：3%的乙腈-0.05mol/L KH2PO4 水溶液（v/v） ；流速 1 mL/min；柱温 30℃，紫外检测波长 265 nm；进样量10μL。

2.2 实 验 步 骤2.2.1 仪 器 准 备按操作说明开启液相色谱仪，设定方法参数2.2.2 样 品 准 备准确称取切碎的蔬果样品 5.0g，以 1mol/L 乙酸 50 mL 为萃取溶剂，微波功率设为自动，萃取时间为 10 min，萃取温度设定为 50℃，平行萃取两次（本次实验只萃取 1 次） 萃取液过滤后用 1mol/L 乙酸溶液定容至 100 mL，制成供试品溶液2.2.3 定 性 分 析分别取 10μL 50 mg/L 的 Vc 标准溶液和供试品溶液，进 HPLC 分析根据保留时间定性分析蔬果中的 Vc2.2.4 校 准 曲 线 绘 制分别配制 5，20，50，80，100 mg/L 的 Vc 样品溶液，待液相色谱稳定后进样分析，平行测定 3 次以 Vc 色谱峰高对浓度作图，绘制校准曲线2.2.5 定 量 分 析供试品溶液经 0.45μm 微孔滤膜过滤后进行 HPLC 分析平行测定 2 次，记录其 Vc 的色谱峰面积，根据校准曲线计算蔬果样品中 Vc 的含量，结果以 mg/100g 表示3 实 验 结 果3.1 标 准 曲 线 的 绘 制表 1Vc 标准样品的高效液相色谱数据微波辅助提取-高效液相色谱法测定蔬果中的 Vc 含量3CVc/mg·L-1 保留时间/min 峰面积5 3.039 15064720 2.910 61393650 2.918 161320180 2.937 2524154100 2.946 3359268以 Vc 标准系列溶液的色谱峰高对其浓度作图，经线性拟合得到如图 1 所示的校准曲线。

图 1 Vc 色谱峰高对浓度的标准曲线由线性拟合得出色谱峰高对浓度的标准曲线方程为 y = 32600x-44230，相关系数为 R² =0.99713.2 三 份 水 果 样 品 的 液 相 色 谱 图微波辅助提取-高效液相色谱法测定蔬果中的 Vc 含量4图 2 火龙果样品的 HPLC 谱图图 3 猕猴桃的 HPLC 谱图图 4 鸭梨的 HPLC 谱图微波辅助提取-高效液相色谱法测定蔬果中的 Vc 含量53.3 样 品 相 关 数 据 及 Vc 含 量 的 计 算实验测得的样品相关数据如表 2 所示表 2 样品的液相色谱数据与样品质量样品名称 保留时间/min 峰面积 质量/g火龙果 2.931 57115 5.0177猕猴桃 2.964 462889 5.0002鸭梨 2.976 13262 5.0015将各样品的峰面积作为 y 代入线性方程 y = 32600x-44230，可求出各样品中 Vc 的浓度，并进一步计算该样品中 Vc的含量，记于表 3表 3 水果样品中 Vc 浓度与含量样品名称 Vc 浓度/mg·L -1 Vc 含量/(mg/100g)火龙果 3.11 6.20猕猴桃 15.56 31.12鸭梨 1.76 3.52如火龙果的峰面积为 57115，代入标准曲线方程 y = 32600x-44230 中，算得火龙果样品 Vc 浓度为 C1= 57115+4423032600mg·L-1=3.11mg·L-1，故火龙果 样品中的维生素 C 。

同理，猕猴桃样品 Vc 含量含量 为 𝜔=3.11×0.15.0177×100=6.20𝑚𝑔/100𝑔为 31.12 mg/100g，鸭梨样品 Vc 含量为 3.52 mg/100g（存疑） 除鸭梨外，火龙果和猕猴桃的谱图都较为理想鸭梨的谱图有很多杂峰，而且有几个峰与 Vc 的峰强度相当甚至大于其强度虽然有很多杂峰，但根据系列标准 Vc 溶液保留时间，我们可以从鸭梨的谱图上找到其中属于 Vc 的峰但是，这些峰值都是负值，所以得出鸭梨的 Vc 含量十分可疑理论上来说，就算是不含 Vc 的溶液（如流动相的溶液）的峰值也就为零，不会为负值而出现负峰的原因可能有：1、检测器输出信号的极性相反；2、样品的吸收小于流动相，流动相不纯；3、样品溶剂干扰；4、示差折光检测器中样品的折射率较低；5、进样中带入气泡4 思 考 和 结 论4.1 思 考 题1、校准曲线法有何优缺点？液相色谱法中常用的定性定量方法有哪些？答：校准曲线法优点：测定工作简单，可直接从标准工作曲线上读出含量，适合大量样品的分析标准曲线法的缺点是：每次样品分析的色谱条件（检测器的响应性能，柱温，流动相流速及组成，进样量，柱效等）很难完全相同，因此容易出现较大误差。

此外，标准工作曲线绘制时，一般使用欲测组分的标准样品（或已知准确含量的样品） ，而实际样品的组成却千差万别，因此必将给测量带来一定的误差微波辅助提取-高效液相色谱法测定蔬果中的 Vc 含量6液相色谱法中常用的定性方法有用已知纯物质对照定性、用文献值进行定性分析、根据相对保留值定性、与其他方法联用定性（如与质谱联用）等方法可根据峰面积或峰高进行定量分析，具体计算方法有归一化法、标准曲线法、内标法、标准加入法2、如何快速建立未知物的液相色谱方法？一般应考虑哪些主要因素？答：建立未知物的液相色谱方法应该考虑两个方面的因素，一方面是选择合适的色谱柱，色谱柱是液相色谱分析的核心组件，应根据分析对象的性质选取合适的色谱柱，如正向色谱、反向色谱和离子交换色谱等等；另一方面是流动相的选择，溶剂的极性是选择的重要依据，应该使用高纯度试剂做流动相，防止微量杂质长期积累和损坏色谱柱和使检测器噪声增加，同时应避免流动相与固定相发生作用使柱效下降或者损坏柱子，试样在流动相中应有适宜的溶解度防止沉淀在柱中积累还有流动相要满足检测器需求3、微波辅助萃取法为何能达到快速高效的萃取效果？答：微波具有穿透到物质内部的本质，穿透的深度一般是从几毫米到几十厘米的范围，随频率不同而异。

所以除了极大的物体外，微波能做到被加热的物体里外同时加热，这就大大缩短了加热时间，微波的这种加热速度快、均匀特点使得在用微波辅助提取技术时，消耗的时间和原料、试剂量都有显著的减少4、试比较液相色谱法和气相色谱法的优缺点答：液相色谱法分离效率较气相色谱法低，需使用有机溶剂和价格昂贵的高压泵，价格和运行费用较高，优点是能分离和分析高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质，其流动相可选用不同极性的液体，对组分可产生一定的亲和力，对分离起很大的作用，并且在室温下工作；气相色谱分离效率高，费用低，故障率低，但只限于分析气体和沸点较低的化合物，适用面较窄，而且一般都要在较高温度下进行4.2 结 论本实验用微波辅助提取法以 1mol/L 乙酸萃取 3 组质量分别为 5.0177g、5.0015g、5.0002g 的不同水果样品中的 Vc，用高效液相色谱法对其进行分析测定由系列 Vc 标准溶液可得标准曲线方程 y = 32600x-44230，相关系数为 R² = 0.9971将样品的 Vc 峰面积值代入标准曲线，可得出火龙果，猕猴桃，鸭梨 Vc 的浓度分别为 3.11mg·L-1、15.56mg·L -1、1.76mg·L -1，含量分别为 6.20mg/100g、31.12mg/100g、3.52mg/100g。

在实验过程中应该出现了问题，因为鸭梨的峰值都是负值，因鸭梨是最后一个测定的，故无法知道是仪器问题还是样品的问题高效液相色谱法测定蔬果中的维生素C 含量，具有分析速度快、操作简单、灵敏度高、准确性高、试剂用量少等优点参 考 文 献[1] 张 畅 . 富 含 维 生 素 C 的 蔬 果 ,《 东 方 药 膳 》 , 2015(3):5-5[2] 杨 晶 晶 ， 刘 英 ， 曲 媛 ， 崔 秀 明 ， 黄 璐 琦 . 不 同 方 法 测 定 三 七 花 、 茎 叶 中 维 生 素 C 含 量 .《 食 品 工 业 科 技 》 , 2014, 35(24):53-56[3] 冯 爱 玲 . 用 荧 光 光 度 法 测 定 果 蔬 品 中 的 VC 含 量 .《 山 东 化 工 》 , 2015, 44(18):64-65 [4] 刘 燕 。