基因工程产品分离纯化技术课件.pptx

基因工程产品分离纯化技术内容一.基因工程表达产物的特点二.基因工程药物分离纯化技术的要求三.分离纯化的基本过程四.如何选择分离纯化的方法五.基因工程产品中试的研究一、基因工程表达产物的特点一、基因工程表达产物的特点一、基因工程表达产物的特点一、基因工程表达产物的特点 基因工程药物的分离、纯化非基因工程药物的分离、纯化非常重要表达的产物都是多肽或常重要表达的产物都是多肽或蛋白质蛋白质 它的制得具有以下它的制得具有以下 特点：特点：表达产物在初始料中含量较低；表达产物在初始料中含量较低；含有大量细胞及代谢产物；含有大量细胞及代谢产物；表达产物稳定性差，易失活变性；表达产物稳定性差，易失活变性；表达产物的种类繁多、结构不一、表达产物的种类繁多、结构不一、活性各异；活性各异；对其质量要求纯度高、无菌、无热原对其质量要求纯度高、无菌、无热原二、分离纯化的技术要求二、分离纯化的技术要求二、分离纯化的技术要求二、分离纯化的技术要求技术条件温和能保持产物生物活性技术条件温和能保持产物生物活性选择性好，能从复杂的混合物中有效的将选择性好，能从复杂的混合物中有效的将目的产物分离，达到较高的纯化倍数目的产物分离，达到较高的纯化倍数。

收率要高收率要高两个技数间能直接衔接，两个技数间能直接衔接， 不需要对物料加以处理不需要对物料加以处理纯化过程要快，满足高纯化过程要快，满足高 生产率的要求生产率的要求细胞破碎与固液分离细胞破碎与固液分离细胞收集：细胞收集： 离心法、膜分离离心法、膜分离法 细胞破碎：机械破碎法、非细胞破碎：机械破碎法、非机械破碎法机械破碎法 固液分离固液分离目的产物含有大量杂质必须进行分离目的产物含有大量杂质必须进行分离纯化 蛋白质分离纯化方法的设计根据其蛋白质分离纯化方法的设计根据其分子的理化性质和生物学特性来决定分子的理化性质和生物学特性来决定2. 目的产物的分离纯化目的产物的分离纯化 产产 物物 特特 性性 作作 用用 等电点等电点 决定离子交换种类及条件决定离子交换种类及条件相对分子量相对分子量 选择不同孔径的介质选择不同孔径的介质疏水性疏水性 与疏水、反相介质结合的程度与疏水、反相介质结合的程度生物特异性生物特异性 决定亲和配基决定亲和配基溶解性溶解性 决定分离体系及蛋白浓度决定分离体系及蛋白浓度稳定性稳定性 决定工艺采用温度及流程时间决定工艺采用温度及流程时间产物的特性在分离纯化中的作用产物的特性在分离纯化中的作用热原质的去除热原质的去除 热原质是肠杆菌科产生热原质是肠杆菌科产生的细菌内毒素（脂多糖）去除困难。

分的细菌内毒素（脂多糖）去除困难分子量小的多肽或蛋白质中的热原可用超子量小的多肽或蛋白质中的热原可用超滤或反渗透，脂多糖是阴离子可用阴离滤或反渗透，脂多糖是阴离子可用阴离子交换层析除去，脂多糖是疏水性可用子交换层析除去，脂多糖是疏水性可用疏水层析法疏水层析法病毒的去除病毒的去除 层析或过滤可将病毒去除层析或过滤可将病毒去除 三、分离纯化的基本过程三、分离纯化的基本过程三、分离纯化的基本过程三、分离纯化的基本过程分离纯化原则分离纯化原则分离策略分离策略粗纯粗纯色谱技术与精纯色谱技术与精纯（一）、分离纯化原则（一）、分离纯化原则要建立一个方便灵敏的蛋白检测方法，以估价每一步的提纯程度；分离步骤要尽可能少；初步分离要快速，精纯要高分辨率；尽可能避免带入有害物质;每步需统计： 得率、纯度、纯化倍数（二）、分离纯化策略（二）、分离纯化策略（三）、粗纯（三）、粗纯固液分离固液分离固液分离固液分离胞内表达胞内表达分泌表达分泌表达菌体菌体包涵体包涵体裂解液裂解液复性液复性液上清上清粗提液粗提液捕获目的产捕获目的产物物破菌、离心、洗涤破菌、离心、洗涤破菌、离心、洗涤破菌、离心、洗涤柱层析柱层析柱层析柱层析/ /沉淀沉淀沉淀沉淀/ /超滤超滤超滤超滤裂解：尿素、盐酸胍裂解：尿素、盐酸胍裂解：尿素、盐酸胍裂解：尿素、盐酸胍复性：稀释、柱复性复性：稀释、柱复性复性：稀释、柱复性复性：稀释、柱复性How to break the bacteria cells?Ultrosonication High-pressure homogenizerSeperation and clarificationCross-flowfiltrationHigh-speedCentrifugation（四）精纯（四）精纯除宿主来源除宿主来源DNADNA除宿主来源蛋白质除宿主来源蛋白质除宿主来源内毒素或致病因子除宿主来源内毒素或致病因子除目的产物的异构体除目的产物的异构体色谱技术的应用色谱技术的应用精纯的主要目的：精纯的主要目的： 基本原理是分析样品作为流动相流过固相时，由基本原理是分析样品作为流动相流过固相时，由于样品中的各个成分与固相相互作用不同使得样品于样品中的各个成分与固相相互作用不同使得样品中的各个成分通过固相的速率产生了差别，从而达中的各个成分通过固相的速率产生了差别，从而达到分离样品中各个成分的目的。

到分离样品中各个成分的目的 层析因固相介质不同又分为层析因固相介质不同又分为离子交换层析离子交换层析离子交换层析离子交换层析、分分分分子筛层析子筛层析子筛层析子筛层析和和吸附层析吸附层析吸附层析吸附层析等各种层析等各种层析色谱分离原理色谱分离原理 将作为固相成分的将作为固相成分的不溶性基质，例如葡不溶性基质，例如葡聚糖凝胶、纤维素、聚糖凝胶、纤维素、树脂等填充到柱子中，树脂等填充到柱子中，用平衡液平衡用平衡液平衡 然后加样品，再用然后加样品，再用适当的溶剂洗脱适当的溶剂洗脱 样品中各种成分通样品中各种成分通过柱子取决于与固相过柱子取决于与固相成分的相互作用，最成分的相互作用，最后以不同速率被洗脱后以不同速率被洗脱出来，达到将各个成出来，达到将各个成分分离的目的分分离的目的常用色谱分离技术凝胶过滤（分子排阻）层析（GF，SEC）离子交换层析（IEX）疏水作用层析（HIC）亲和层析（AC）反相色谱层析（RPC）医学全( )（四）精纯（四）精纯（1 1）（四）精纯（四）精纯（2）2-3步柱层析：离子交换（IEX）、疏水 （HIC）、凝胶过滤（GF）尽量避免采用亲和层析（AC）尽量避免采用反相层析（RPC）除细菌内毒素用阴离子交换（AEX）AIEXTechniqueUltrafiltrationUFSuperdex200p.g.GFPurificationfactorQSepharoseFF 10 timespurification82%yieldPhenylSepharoseHPHICY.-F. Liao et al. (1996)J. Biol. Chem. 271, 2834863622719Purification of recombinant a a-mannosidase from Pichia pastoris中试规模中压层析系统中试规模中压层析系统AKTA AKTA explorer 100explorer 100AKTA explorer 100AKTA explorer 100色谱系统工作流程色谱系统工作流程根据产物表达形式来选择根据产物表达形式来选择四、如何选择分离纯化的方法四、如何选择分离纯化的方法四、如何选择分离纯化的方法四、如何选择分离纯化的方法n 分泌型表达产物的发酵液体积很大分泌型表达产物的发酵液体积很大但浓度较低纯化前必须浓缩可用沉淀但浓度较低纯化前必须浓缩可用沉淀和超滤法。

和超滤法n产物在周质表达是介于细胞内可溶性表产物在周质表达是介于细胞内可溶性表达和分泌表达的一种形式达和分泌表达的一种形式, ,它可以避开可它可以避开可溶性表达蛋白和培养基中蛋白类杂质溶性表达蛋白和培养基中蛋白类杂质, ,在在一定程度上有利于分离纯化一定程度上有利于分离纯化. .为了获得周为了获得周质蛋白经低浓度溶菌酶处理后质蛋白经低浓度溶菌酶处理后, ,可采用渗可采用渗透压休克的方法来获得透压休克的方法来获得n可溶性表达产物破菌后的细胞上清，可溶性表达产物破菌后的细胞上清，首选亲和分离方法，或离子交换层首选亲和分离方法，或离子交换层析根据分离单元之间的衔接选择根据分离单元之间的衔接选择 应选择不同机制的分离单元组成一应选择不同机制的分离单元组成一套分离工艺，尽早采用高效的分离手段套分离工艺，尽早采用高效的分离手段 u 先将最多的杂质去除，将费用最高、最费先将最多的杂质去除，将费用最高、最费时的分离单元放在最后阶段时的分离单元放在最后阶段u随后采用高分辨率的操作单元（离子交随后采用高分辨率的操作单元（离子交换层析和亲和层析）凝胶过滤放在最后，换层析和亲和层析）凝胶过滤放在最后，这样可以提高分离效果。

这样可以提高分离效果u 层析分离次序的选择同样重要，合理层析分离次序的选择同样重要，合理的组合能提高分辨效率，并有利于各步的组合能提高分辨效率，并有利于各步骤间的过渡如离子交换层析、亲和层骤间的过渡如离子交换层析、亲和层析、凝胶过滤析、凝胶过滤分离纯化工艺应遵循以下原则： 具有良好的稳定性和重复性 尽可能减少组成工艺的步骤 各技术步骤间要相互适应和协调根据分离纯化工艺的要求来选根据分离纯化工艺的要求来选择择工艺过程中尽可能少用试剂工艺过程中尽可能少用试剂 工艺所用时间要短工艺所用时间要短 工艺和技术必须高效收率高易操作工艺和技术必须高效收率高易操作能耗低能耗低 具有较高的安全性具有较高的安全性SDS- PAGE1.Total proteins2.High Salt3.Ion exchange4.Gel-filtration5.Affinity中试研究的概念与原则中试研究的概念与原则中试的研究内容中试的研究内容中试样品的用途中试样品的用途五、基因工程药物的中试研究五、基因工程药物的中试研究五、基因工程药物的中试研究五、基因工程药物的中试研究医学全( )一、中试研究的概念与原则一、中试研究的概念与原则中试研究的概念：中试研究的概念： * *从实验室阶段向生产阶段过渡的一个中从实验室阶段向生产阶段过渡的一个中 间阶段；间阶段； * *是在中试规模下，对一系列工艺参数和是在中试规模下，对一系列工艺参数和 质量控制体系进行研究的过程；质量控制体系进行研究的过程； * *目的是建立一条完全模拟生产实际状况目的是建立一条完全模拟生产实际状况 的小型质控与生产流水线。

的小型质控与生产流水线生产的批量要达到一定的规模，以满足检定、稳定生产的批量要达到一定的规模，以满足检定、稳定性研究、非临床研究和临床试验需要性研究、非临床研究和临床试验需要工艺要稳定（观察工艺要稳定（观察3-5批）、工艺规模可同等条件放批）、工艺规模可同等条件放大大需建立生产全过程的质控体系需建立生产全过程的质控体系要符合要符合GMP条件条件要符合成本控制原则要符合成本控制原则中试研究的原则：中试研究的原则：二、中试研究的内容二、中试研究的内容发酵发酵发酵发酵分离纯化分离纯化分离纯化分离纯化制剂配制制剂配制制剂配制制剂配制培养基和各参数对生长曲线、培养基和各参数对生长曲线、培养基和各参数对生长曲线、培养基和各参数对生长曲线、表达曲线、表达水平、总产量表达曲线、表达水平、总产量表达曲线、表达水平、总产量表达曲线、表达水平、总产量的影响指标：的影响指标：的影响指标：的影响指标：表达水平、蛋表达水平、蛋表达水平、蛋表达水平、蛋白总量、菌重白总量、菌重白总量、菌重白总量、菌重/ /体积体积体积体积各分离纯化步骤的参数对下各分离纯化步骤的参数对下各分离纯化步骤的参数对下各分离纯化步骤的参数对下述指标的影响：述指标的影响：述指标的影响：述指标的影响：纯度、产量、纯度、产量、纯度、产量、纯度、产量、得率、比活性得率、比活性得率、比活性得率、比活性等等等等各参数对各参数对各参数对各参数对工艺得率、半成品工艺得率、半成品工艺得率、半成品工艺得率、半成品及成品质量及成品质量及成品质量及成品质量的影响。