临床医学论文-噬菌体展示技术在肝癌肿瘤血管异质性研究中的应用和优化.doc

III临床医学论文.噬菌体展示技术在肝癌肿瘤血管异质性研究中的应用和优化作者：徐泱 孙惠川汤钊猷 樊嘉周俭 钦伦秀 刘银坤【摘要】 目的克服体内噬菌体展示技术在肝癌肿瘤血管异质性研究中应用的 技术障碍方法采用噬菌体体内分布及代谢实验研究噬菌体在裸鼠体内的分布 及代谢规律，比较噬菌体饱和灌注、聚肌甘(Poly I )及不同的活体灌洗技术对 组织中噬菌体分布的影响结果肝脏等网状内皮系统器官可非特异性结合噬菌 体这种结合可被空白噬菌体饱和灌注所抑制(P<0.01)，而Poly I无显着影响(P>0.05)o左、右心室加门静脉灌洗较单纯左心室灌洗可显着减少组织血管中血液及未结合噬菌体的残留(P<0.01)o结论经过改进优化的体内噬菌体展示技术 可为肝癌肿瘤血管异质性研究提供稳定、高效的技术平台关键词】噬菌体展示；肝肿瘤；肿瘤血管；异质性[Abstract 1 Objective To circumvent the obstacle of in vivo phage display for study of vascular heterogeneity in hepatocellular carcinoma. Methods The distribut ion and metabolic 1 aw of phage in the athymic mouse was detected by using in vivo phage display and metabolic experiment to compare the effects of fl tel phage pre saturation, Poly I pre inject ion and modi fied perfusion on distribut ion of phage in the t issues. Results The non specific phage trapped by liver (belonged to the reticuloendothelial system, RES) was decreased significantly by pre saturation of f i lamentous insert less phage (P<0.01), but not affected by the pre injection of Poly I (P>0.05).Left and right ventricle plus portal vein lavage could more significantly decrease blood volume in the vessels and residuals of untrapped phage (P<0.01). Conclusion The modified in vivo phage display offers an ideal method for study of vascular heterogeneity in hepatocellular carcinoma.[Key words] Phage display; Liver tumors; Tumor vasculature; Hctcrogcnci ty肿瘤血管“异质性”是血管生成研究中的热点。

噬菌体文库体内展示技术在 1996年一出现，就立刻成为血管异质性研究的理想工具[1-2] o现在，应用噬 幽体展示体内筛选技术已得到针对不同组织或肿瘤血管的特异性靶向分子[3-4]但肝、脾等属于网状内皮系统的器官能够非特异性地吞噬或吸附噬菌 体，而一直未有相关报道[5]本研究的主要目的是探讨克服肝脏对噬菌体文 庠非特异性吞噬或吸附的方法，建立稳定、高效的肝癌噬萌体文库体内展示技术 平台，为肝癌肿瘤血管异质性研究提供强有力的工具1材料与方法1.1材料1.1.1实验动物：6周龄雄性BALB/c裸鼠，平均15〜20 g,购自中科院 上海药物所，饲养在25 C恒温SPF级层流室，12 h光照和12 h黑暗交替，自 由进食标准颗粒饲料及饮水1.1.2噬菌体文库：Ph.D. 7噬菌体随机7肽库及M13mpl9空白对照噬菌体购自美国NEB公司(Cat.No. E8100S； N4019S), fl tet空白噬菌体由中科 院上海生物化学研究所惠赠1.1.3其它试剂：聚肌昔(Poly 1 )及兔抗M13噬菌体抗体购自美国Sigma 公司(Cat.No. 81354； B7786), ABC免疫组化试剂盒购自上海华美生物工程公司。

1.2方法1.2.1肝癌原位种植裸鼠模型制备：按照我所李雁等［6］方法在雄性 BALB/c裸鼠上制备高转移人肝癌原位种植模型1.2.2噬菌体文库体内展示常规流程：动物麻醉后予尾静脉注射噬菌体 5〜8 min后活体心脏灌洗灌注结束后切下目标组织及对照组织，匀浆后反复 洗涤，加入宿主细菌(ER2738大肠杆菌)复苏组织中的噬菌体测定滴度目标组 织中的噬菌体扩增后作下一轮筛选之用o1.2.3抗噬菌体免疫组化染色：染色方法按试剂盒说明书ABC法进行：组 织切片常规脱蜡至水，3% H202室温处理10 min,微波抗原修复2次共8 min, 加10%山羊血清37 C 20 min；加1 ： 1 000稀释的兔抗M13噬菌体抗体室温1 h； PBS洗3次各5min；滴加1 ： 500稀释的羊抗兔生物素化二抗37 C30min； PBS 洗3次各5 min；滴加ABC液37 C 30 min, PBS洗3次各5 min；滴加DAB显 色液；PBS冲洗3 min中止；苏木素复染、脱水、中性树胶封片结果观察：细 胞膜或胞质内出现棕黄色颗粒阳性染色，如阳性颗粒数少于每高倍视野3处判为 阴性，反之则为阳性每次均以PBS代替一抗作为阴性对照。

1.2.4噬菌体体内分布及代谢实验:荷肝癌裸鼠分为12组，每组4只,0.5% 戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔注射麻醉，其中一组经尾静脉注入1 X1012 pfu的M13 空白噬菌体,分别在 1、4、10、30 min、1、2、6、12、24、48 及 72 h 后 活体心肝灌洗；另一•组在注射1 X1012pfu的文库噬萌体4min后活体心肝灌洗灌洗结束后，立刻取出肿瘤及对照组织(肝脏、肺、肾脏、脑)剪碎匀浆、洗涤离 心后称重，加100 u 1 1%的NP 40冰浴5min使细胞溶解;加900 ul的ER2738 大肠杆菌培养液室温下共育20 mine将共育物全部倒入内有9 ml LBT培养液的 50而离心管中室温下共育30 min,测定单位组织中噬菌体滴度其余组织予常 规固定、石蜡包埋、切片，抗噬菌体免疫组化染色观察噬菌体在组织中的分布1.2.5活体灌洗技术比较实验：荷肝癌裸鼠分为2组，每组4只，麻醉后 经尾静脉注射1 X1012 pfu的M13空白噬菌体7 min后，一组以常规灌洗方法 进行活体灌洗，即将注射器针头插入左心室以2 ml/min的速度灌注20 ml的PBS, 灌注开始后立即剪开右心房；另一组在灌洗PBS液中加入一定量的肝素(50 U/ml),在左心室灌注完后，再灌洗右心室，慢速(2 ml/min)灌洗20 ml,随后 穿刺门静脉，以5 ml/min继续灌洗20 mb灌洗结束后应看到肝、肿瘤、肺、 肾等完全均匀变白。

切取肝脏、肿瘤及其它对照组织，复苏各组织中结合的噬菌 体测定滴度1.2.6 Poly I抑制实验：荷肝癌裸鼠分为6组，每组4 Ao Poly 1 (200、 350及500 ug/100 u 1 PBS)3个剂量组和PBS对照组,均在注射1X1012 pfu 的M13空白噬菌体前5 min预先经尾静脉注入裸鼠体内；另2组在静脉注射500 u g Poly I (或100 u 1 PBS)后5 min,尾静脉注射1X 1012 pfu的文库噬菌体 噬菌体注射7 min后活体心肝灌洗，切取肝脏、肿瘤及其它对•照组织，复苏各组 织中结合的噬菌体测定滴度1.2.7噬菌体饱和灌注实验：荷肝癌裸鼠分为18组，每组2只，M13空白 噬菌体或fl tet空白噬菌体各9个剂量组(IX 106〜IX 1014 pfu, 10倍梯度增加)，分别注入裸鼠体内，7 min后切取肝脏和肿瘤，复苏其中结合的噬菌体 测定滴度荷肝癌裸鼠分为4组，每组4只，在注入1 X1012pfu的文库噬萌体 （或M13空白噬菌体）前5 min将1X1012 pfu的fl tet空白噬菌体（或PBS） 经尾静脉注入荷瘤裸鼠体内，在噬菌体注射7 min后活体心肝灌洗，切取肝脏、 肿瘤及其它对照组织，复苏各组织中结合的噬幽体测定滴度。

1.3统计学分析数据用SPSS 11.0处理，结果以土s表示单因素方差分析比较各组内参数 差异，配对资料采用配对t检验P<0.05为差异有统计学意义2结果2.1噬菌体体内分布及代谢实验肝脏可大量非特异性地结合血液循环中的噬菌体，其结合的噬菌体较其它器 官（组织）高约10〜1 000余倍，肿瘤亦有非特异性结合噬菌体的能力（图1）噬 菌体主要经肝肾代谢，噬菌体在血液中的代谢周期约为72h（图2）在注射噬菌 体后4 min,从肝脏与肿瘤中复苏的文库噬菌体与Ml3噬菌体的数量比较差异无 统计学意义（P>0.05），而在其它组织中差异有统计学意义（P<0.01,图3）2.2不同活体灌洗技术的比较改良灌洗组，肝、肿瘤、肾、肺组织中的M13空白噬菌体数较传统灌洗组显 着降低（肝、肿瘤、肾脏：P<0.05；肺：P<0.01）,平均下降到10%左右（图4） 活体灌洗并不影响噬菌体增殖活性2.3 Poly I抑制实验注射M13噬if体及文库噬if体的Poly I各剂量组与PBS对照组之间比较差异无统计学意义（P>0.05）o2.4噬菌体饱和灌注实验肝脏及肿瘤中结合的噬菌体数量随fl tet空白噬菌体注入量的增大而逐渐增加，但当注入噬菌体W1012 pfu后，肝脏及肿瘤中结合的噬菌体数量就稳 定保持在1011 pfu及106pfu而不再增加；M13与fl lei噬菌体变化基本一 致（图5、6）o经过量的fl tct空白噬菌体（1012pfu）预饱和后，肝脏、肿瘤、肾脏、肺及脑组织与M13空白噬菌体的结合均显着被抑制（肝、肿瘤、肾、肺： P<0.01；脑：P<0.05）；肝脏、肿瘤、肾脏及肺组织结合文库噬菌体较PBS对照 组亦显着减少（P<0.01）,肝脏所结合噬菌体与其它组织的差异明显减少（图7）。

3讨论越来越多的证据表明，肿瘤血管生成在肿瘤生长、转移和复发的各个环节均 有重要作用［7.8］肿瘤血管具有不同于正常血管的“异质性”也己逐渐取得 共识［9］肿瘤血管研究方面的进展，都离不开研究技术手段的进步其中噬 菌体文库体内展示技术在“血管异质性”研究方面发挥了重要的作用噬菌体展 示技术由美国Smith ［10］在1985年首先报道，其原理是将序列不同而长度相 同的合成寡核甘酸插入到噬菌体衣壳蛋白基因序列之中，外源多肽就可以表达在 噬菌体衣壳蛋白的表面，由此就可能生成巨大的、可以展示数千万个肽的重组噬 菌体文库1996年，Pasqual ini又在噬菌体文库体外展示技术的基础上发展出 噬菌体文炸体内展示技术［1］,即把噬菌体文炸注入动物体内，直接在血管内（或 体腔内）筛选可与靶器官或组织的血管表面分子（或体腔的表面分子）特异结合的 噬菌体，进而得到噬菌体表而展示的具靶向作用的多肽分子现在，应用噬菌体 展示体内筛选技术己得到针对许多肿瘤及一些血管生成相关疾病的特异性靶向 分子这些靶向分子可用于显示肿瘤血管或利用特异靶向分子阻断生长因子配体 与。