维生素b12的生物合成、发酵生产与应用.pdf

生 物 工 程 学 报 Chin J Biotech 2008, June 25; 24(6): 927-932 Chinese Journal of Biotechnology ISSN 1000-3061 cjb@ © 2008 Institute of Microbiology, CAS Accepted: April 7, 2008 Supported by: the National Project of Scientific and Technical(No. 2007BAI46B06). Corresponding author: Hong Yi. Tel: +86-311-88632172; E-mail: yihonglaoshi@ “十一五”国家科技支撑计划项目(No. 2007BAI46B06)资助 综 述 维生素 B12的生物合成、发酵生产与应用 马蕙, 王丽丽, 张春晓, 仪宏 河北科技大学生物科学与工程学院, 石家庄 050018 摘 要: 维生素 B12(VB12)是一种重要的动物和人类营养因子, 广泛应用于饲料、食品和医药卫生领域。

中国已成为全球VB12 的主要产地, 2007 年产量为 27 t, 占全球总产量的 77%VB12是目前已发现的最大、最复杂的维生素分子, 化学合成极其困难, 所有 VB12产品均采用生物发酵制备其主体结构VB12主要由古生菌和一些真细菌通过有氧或厌氧两种途径合成, 工业上主要采用费式丙酸菌(Propionibacterium freudenrechii） 和脱氮假单胞菌(Pseudomonas denitrificans)进行发酵生产综述了 VB12的基本性质, 生物合成途径, 以及发酵生产工艺, 并对 VB12的应用与市场前景作了分析 关键词: 维生素 B12, 生物合成, 发酵, 应用 Biosynthesis, Fermentation and Application of Vitamin B12 – a Review Hui Ma, Lili Wang, Chunxiao Zhang, and Hong Yi College of Bioscience and Bioengineering, Hebei University of Science 其结晶为红色, 故又称红色维生素。

VB12最初是由 Minot 和 Murphy 于 1926 年用肝浸膏治疗恶性贫血时发现[1], 1948 年由 Rickes 和 Smith 分别从肝脏中纯化和结晶[2,3], 1956年由 Hodgkin 等用 X-射线法证明了其晶体结构[4], 如图 1 所示, 即中心咕啉环、 中心环轴向 Coβ配基部分及 1 个含有核苷酸环的 Coα配基中心咕啉环由相连的 4 个吡咯和 1 个钴原子组成, 钴螯合在 4 个吡咯中心咕啉环轴向上方的配基不同(即 Coβ配基 928 ISSN1000-3061 CN11-1998/Q Chin J Biotech June 25, 2008 Vol.24 No.6 J 不同), 则会产生不同形式的钴胺素类物质, 如腺苷钴 胺 素 (Adenosylcobalamin) 或 甲 基 钴 胺 素(Methylcobalamin) 由于其结构复杂, 所以它也是自然界中生物合成途径最繁琐的小分子生物物质[5]1972 年美国科学家伍德沃德(Woodward, R.B)领导100 多个合作者历时 11 年, 共同完成了全化学合成工作[6]。

2 维生素B12的生物合成 作为最复杂的和十分重要的小分子, VB12的生物合成已有详尽研究VB12主要由古生菌和一些真细菌通过有氧或厌氧两种途径合成, 涉及到相关合成基因 30 余个[5], Battersby、Blanche、Scott、 Warren、Escalante-Semerena 等通过对脱氮假单胞菌 图 1 维生素 B12及其衍生物的结构[5] Fig. 1 Structure of vitamin B12 and some of its derivatives The numbering and labeling of the molecule are shown together with the names used to refer to incomplete derivatives of the compound (Pseudomonas denitrificans)的研究, 阐明了 VB12好氧合成路径[5,7–11]对厌氧合成路径的研究主要源于以 下3种 菌 : 鼠 伤 寒 沙 门 氏 菌 (Salmonella typhimurium)[12]、 巨 大 芽 孢 杆 菌 (Bacillus megaterium)[13]和 费 氏 丙 酸 杆 菌 (Propionibacterium freudenreichii)[14], Roessner 和 Scott 对 VB12的厌氧合成路径做了专门综述[15]。

2.1 ALA 的生物合成 VB12的生物合成从五碳前体 5-氨基乙酰丙酸(5-aminolaevulinic acid, ALA)开始[11]ALA 可通过C4 或 C5 两条途径合成C4 途径中, 由琥珀酰 CoA和甘氨酸在 ALA 合成酶的催化下合成 ALAC5 途径从谷氨酸开始, 在谷胺酰-tRNA 合成酶的催化下, 谷氨酸转移到 tRNA 分子上, 形成谷胺酰-tRNA, 谷胺酰-tRNA 在谷胺酰-tRNA 脱氢酶的作用下, 合成谷胺醛(glutamate 1-semialdehyde, GSA), 再经谷胺醛氨基转移酶的催化合成 ALA[11] 2.2 从 ALA 到尿卟啉原ⅢⅢ的生物合成 这是好氧途径和厌氧途径共同的步骤, 该过程由 ALA 脱水酶(HemB)催化 2 个 ALA 分子形成胆色素原(Porphobilinogen), 再经胆色素原脱氨酶(HemC)催 化 形 成 含4个 吡 咯 的 分 子 前 尿 卟 啉 原(preuroporphyrinogen), 再 由 尿 卟 啉 原 Ⅲ 合 成 酶(HemD)催化 4 个吡咯分子环化形成尿卟啉原Ⅲ(uroporphyrinogen Ⅲ)[10]。

2.3 由尿卟啉原Ⅲ到前咕啉 6(precorrin 6)或钴- 前咕啉 6(Co-precorrion 6)的生物合成 该过程涉及环缩合和去乙酰基, 是好氧过程和厌氧过程主要不同的环节在好氧合成途径中形成前咕啉 6, 催化这一过程需要 5 个依赖于 SAM(S-腺苷-L-甲硫氨酸) 的甲基转移酶(CobA, CobG, CobJ, CobM 和 CobF)逐步转移 6 个甲基基团, 并以单加氧马蕙等: 维生素 B12的生物合成、发酵生产与应用 929 J 酶催化氧原子的结合而著称[10] 在厌氧合成途径中则将尿卟啉原Ⅲ转化成钴-前咕啉 6该过程也需要 5 个甲基转移酶(CysG 或CbiK, CbiL, CbiH, CbiF), 但不同的是早期将钴原子并入到大环中合成前咕啉 2 之后, 即将钴原子螯合到大环中, 形成钴-前咕啉 2, 具有螯合钴原子的酶在不同生物中所催化的酶不同, 如 S. typhimurium的 CysG、CbiK 和 P. freudenreichii、B. megaterium的 CbiX 酶都有相同的酶活性 2.4 将前咕啉 6/钴-前咕啉 6 转化成腺苷钴胺素 好氧途径中, 前咕啉 6 经还原、甲基化、脱羧、甲基重排及酰胺化反应生成钴(Ⅱ)啉酸 a, c-二酰胺(Cob(Ⅱ)yrinic acid a, c-diamide)。

CobK 还原生成二氢前咕啉 6(Dihydro-precorrin 6), 再经 CobL 催化的C-5和 C-15位的甲基化及脱羧, 合成前咕啉 8, 前咕啉 8 在 CobH 催化下, 经甲基重排形成氢咕啉酸(Hydrogenobyrinic acid), 氢咕啉酸在 CobB 催化下酰胺化形成氢咕啉酸 a, c-二酰胺(Hydrogenobyrinic acid a, c-diamide), 好氧菌利用依赖于ATP的钴鏊合酶(CobNST)催化钴元素插入到氢咕啉酸 a, c-二酰胺的咕啉环中心, 从而得到具有钴元素的中间体, 钴(Ⅱ)啉酸 a, c-二酰胺(Cob(Ⅱ)yrinic acid a, c-diamide)在厌氧途径中没有发现 CobNST 复合物 厌 氧 途 径 中 , 钴 前 咕 啉6在CbiJ 、CbiE(CbiEGH)、 CbiT、 CbiC 和 CbiA 等酶的作用下, 也经过还原、甲基化、脱羧、甲基重排及酰胺化反应生成钴(Ⅱ)啉酸 a, c-二酰胺(Cob(Ⅱ)yrinic acid a, c-diamide)除了厌氧途径中二氢前咕啉 6、前咕 啉 8 和氢咕啉酸由相应的钴化合物替代外, 好氧 和厌氧途径中将前咕啉 6 或钴-前咕啉 6 转化成 腺苷钴胺素过程中的中间产物结构可看作是相 同的[10]。

从钴(Ⅱ)啉酸 a, c-二酰胺之后,好氧和厌氧合成路径又重新趋于一致 钴(Ⅱ)啉酸 a, c-二酰胺经过还原、腺苷化、酰胺化等步骤, 最终合成腺苷钴胺素, 好氧与厌氧途径中的中间产物完全一致, 只是利用的催化酶有所差异[10] 目前 VB12合成路径中的大部分中间产物结构都已阐明, 但仍有少量中间产物如钴-前咕啉 6A, 6B, 7 等的结构尚未阐明[15], 仍在继续研究之中 3 VB12的工业生产 由于 VB12的结构极为复杂, 其化学合成高度繁琐昂贵, 从肝脏等动物组织提取的效率和效益也十分低下, 所以只能通过微生物发酵法来实现商业化生产[16,17] 较早期采用链霉素发酵废液提取, 上个世纪 70 年代被专门发酵取代 3.1 菌株 只有原核微生物才能合成 VB12, 可用于生产的菌株及其报道产率见表 1[18] 其中, P. shermanii 和 P. denitrificans 是目前工业生产 VB12的主要生产菌种, P. shermanii 的生产水平达到 30~40 mg/L, P. denitrificans 的生产水平达到100~160 mg/L 表 1 生产 VB12的各种细菌及其产率 Table 1 Bacteria producing VB12 and the corresponding yield Strain Yield/(mg/L) Bacteria FM-02T 2.6 Rhodopseudomonas sp. 2.3 Methanobacillus omelianskii 8.8 Methanobacillus mixture 35 Micromonospora sp. 11.5 Nocardia gadneri 4.5 N. rugosa 14 Propionibacterium freudenreichii 25 Propionibacterium shermanii 23~39 Propionibacterium vannielli 25 Protoaminobacter ruber 2.5 Pseudomonas denitrificans 59 Streptomyces olivaceus 8.。