实验七 sds-page测定蛋白质分子量.ppt

实验七SDS-PAGE测定蛋白质的分子量实验目的目的•学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原 理 •掌握垂直板电泳的操作方法实验原理 • 带电的颗粒（蛋白质）在电场的作用下，移动 的速度是 Vq • V= d6πrη• 在同一电场强度（v/d）和电极缓冲液（η） 条件下，带电的各种蛋白质成分，移动的速度 决定于各蛋白质的带电量（q）和自身分子的大 小（6πr）若使各蛋白质成分的带电量(q)相 近似时，则各蛋白质成分移动的速度就只决定 于各蛋白质成分自身分子的大小（6πr） 实验原理 • 1967年shapiro等人发现在聚丙烯酰胺凝胶中加入阴离 子去污剂十二烷基硫酸纳（sodium dodecylsulfate， SDS），不影响凝胶的形成，而蛋白质的电泳迁移率则 主要取决于它的自身分子量的大小 • 加入SDS之所以能获得这种效应，是因为SDS能打开蛋 白质分子间的氢键和疏水键，使蛋白质变性成为松散的 线状同时大多数蛋白质的每个氨基酸都能与固定量的 SDS相结合，形成SDS-蛋白质复合物 实验原理 •其结果：（1）由于SDS解离后带有很强的负电荷，致 使SDS-蛋白质复合物都带上了相同密度的负电荷，其电 量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，基本掩盖了不 同种类蛋白质间原有的电荷差异。

•（2）SDS与蛋白质结合后，改变了蛋白质原有构象， 使所有蛋白质水溶液中的形状都近似椭圆柱形 •不同SDS-蛋白质复合物的短轴直径都一样，约为18 nm ，而长轴则与蛋白质分子的大小成正比这样SDS-蛋白 质复合物在凝胶电泳中的迁移率，就不再受蛋白质原有 电荷及其形状的影响了，而只取决于椭圆柱长度，即蛋 白质分子的大小 实验原理 • 需要注意的是：为使SDS与蛋白质能充分的按比例 结合，必须将蛋白质间的二硫键完全打开因此，在 用SDS处理蛋白质样品时，必须同时用巯基乙醇处理 巯基乙醇是一种还原剂，它能使二硫键还原打开， 并在有多余的巯基乙醇存在时，就不会再氧化为二硫 键 • 蛋白质与SDS结合后的复合物都是易溶的，因而有 利于电泳为满足SDS定量地与蛋白质结合，这种聚 丙烯酰胺凝胶电泳的凝胶及电极缓冲体系中都含有 SDS，所以称为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 实验原理 • 1969年Weber和Osborn用此法测定了约40种蛋白质的迁移 率，结果发现，蛋白质的迁移率与其分了量的对数呈直线 关系： • Mw=K（10-bm） • lgMw=lgK-bm • lgMw=K1-bm • Mw=分子量，m=迁移率，b=斜率，K，K1=常数• 用此法可以测得蛋白质的分子量。

实验证明，分子量在12 000~200 000之间的蛋白质，用此法测得的分了量，与其它 方法测得的相比，误差一般在±10%以内，重复性高 实验原理 •应用此法测定分子量时，首先将几种已知分子量的标准 蛋白质混合物，与被测蛋白质同时进行SDS-聚丙烯酰胺 凝胶电泳然后测出各个蛋白质成分的迁移率，再以标 准蛋白质分子量的的对数为纵坐标，迁移率为横坐标， 绘出一条直线型的标准曲线 •被测蛋白质的分子量只要测得迁移率即可从标准曲线上 求出 •如下图所示：几种已知分子量 的标准蛋白质被测蛋白质实验原理 •Weber的实验指出，不同浓度的SDS-聚丙烯酰胺凝 胶适用于不同范围的蛋白质分子量大小的测定如 15%的凝胶适用于分子量在10000～50000范围的蛋白 质；10%的凝胶适用于分子量在10000~70000范围的 蛋白质；5%的凝胶适用于分子量25000~2000000范围 的蛋白质；3.33%的凝胶其胶孔径更大，适用于分予 量更高的蛋白质的测定使用时应根据待测蛋白质 样品的分子量范围选择合适的凝胶浓度，以求获得 好的结果不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳系统不连续性表现在以下方面： • 1.凝胶由上、下两层凝胶组成，两 层凝胶的孔径不同，上层为大孔径的浓 缩胶，下层为小孔径的分离胶。

• 2.缓冲液离子组成及各层凝胶的pH 不同电极缓冲液为pH8.3的Tris-甘氨 酸缓冲液，浓缩胶为pH6.8的Tris-HCl 缓冲液，而分离胶为pH8.8的Tris-HCl 缓冲液 • 3.在电场中形成不连续的电位梯度 • 在这样一个不连续的系统里，存 在三种物理效应，即样品的浓缩效应， 凝胶的分子筛效应和电荷效应，由于这 三种物理效应，使样品分离效果好，分 辨率高8.38.38.86.8浓缩效应•凝胶孔径的不连续性（2种孔径的凝胶）•缓冲液离子成分及pH值的不连续性（2种缓冲体系，3 种pH）：浓缩胶，pH6.8，蛋白质分子的迁移率比Cl- 低，比Gly高•电位梯度不连续性：快离子（ Cl- ）后面形成高电 位梯度区，慢离子（Gly）前面形成低电位梯度区， 高电位梯度和低电位梯度之间的地方，形成一个稳定 而不断向阳极移动的界面，蛋白质分子在界面处浓缩 成一个狭小的中间层分子筛效应蛋白质离子进入分离胶后，条件有很大变化由 于其pH 升高(电泳进行时常超过9.0)，使Gly 解 离成负离子的效应增加；同时因凝胶的浓度升高，蛋 白质的泳动受到影响，迁移率急剧下降。

此两项变化 ，使Gly 的移动超过蛋白质，上述的高电压梯度不复 存在，蛋白质便在一个较均一的pH 和电压梯度环境 中，按其分子的大小移动分离胶的孔径有一定的大 小，对不同相对分子质量的蛋白质来说，通过时受到 的阻滞程度不同，即使净电荷相等的颗粒，也会由于 这种分子筛的效应，把不同大小的蛋白质相互分开 实验材料、主要仪器及主要试剂 •（1）标准蛋白质（见表7-1） •表7-1 蛋白质分子量标准 •蛋白质名称 分子量 •兔磷酸化酶B MW=94000 •牛血清白蛋白 MW=66200 •兔肌动蛋白 MW=45000 •牛碳酸酐酶 MW=33000 •蛋白A MW=26000 •胰蛋白酶抑制剂 MW=20000 •鸡蛋清溶菌酶 MW=14400 •（2）待测蛋白质实验材料、主要仪器及主要试剂 •2、主要仪器：稳压电泳仪、垂直板状电泳槽、烧杯、吸管 •3、主要试剂： •（1）凝胶试剂 •①单体母液：30 g丙烯酰胺，0.8 g甲叉双丙烯酰胺，溶于100 mL蒸馏水中，避光保存于4℃，1个月内可使用。

•②1 mol/L，pH8.8 Tris-HCl缓冲液：Tris 121g，SDS 4g溶于 蒸馏水，用浓盐酸调至pH8.8，用蒸馏水定容至1000 mL •③1 mol/L，pH6.8 Tris-HCl缓冲液：Tris 121g，SDS 4g溶于 蒸馏水，用浓盐酸调至pH6.8，用蒸馏水定容至1000 mL •④10%（W/V）过硫酸铵（APS）（现配现用） •⑤TEMED（四甲基乙二胺）试剂作用图解实验材料、主要仪器及主要试剂 •（2）10×电极缓冲液（pH8.3）：Tris 30.3 g，甘氨酸144.2 g ，SDS 10 g，溶于蒸馏水并定容至1000 mL使用时稀释10倍 •（3）2×样品稀释液：SDS 500 mg，巯基乙醇1 mL，甘油3 mL， 溴酚蓝4 mg，1 mol/L，pH6.8 Tris-HCl 2 mL，用蒸馏水定容至 10 mL按每份0.5~1.0 mL分装，-20℃保存此液制备样品时， 样品若为固体，应稀释1倍使用；样品若为液体，则加入与样品等 体积的原液混合即可 •（4）染色液：考马斯亮蓝R250 1 g，甲醇450 mL，冰醋酸100 mL，加水50 mL，溶解后过滤使用。

•（5）脱色液：醋酸70 mL，甲醇200 mL，加水1730 mL，混匀使 用使用后的脱色液用活性炭吸附后过滤，可以重复使用实验步骤 •1．制板 • SDS-聚丙烯酰胺凝胶配制成后，可以注入由玻璃板构 成的间隙中铸成板状，进行垂直板状电泳 • 板状电泳的形式很多，具体操作根据实验室条件而定 基本操作大体上是根据电泳槽高矮大小，选择两块大小一 样的玻璃板，其中一块一端带有约2 cm高的凹槽两块玻璃 板洗净干燥后，在无凹槽的玻璃板上放一条“间隙条”（塑 料条，胶条都可以，其宽、厚度根据需要而定)然后放上 带凹槽的玻璃扳，将两块玻璃板固定，这样两块玻璃板之间 就形成了一定的间隙可进行灌注聚丙稀酰胺胶液实验步骤 •2．12%分离胶的制备 • 从冰箱中取出制胶试剂，应平衡至室温本实验中分离 胶浓度为12%，凝胶液总用量根据玻璃板的间隙体积而定 按表7-2配制所需浓度的分离胶 •表7-2 12%分离胶的配制（12 mL） •胶浓度 12％ •单体母液（mL） 4.80 •去离子水（mL） 4.20 •分离胶缓冲液（mL） 3.00 •10％APS（μL） 50 •TEMED(μL) 18• 实验步骤 •将上述胶液配好，用玻璃棒充分混匀后，迅速注入两 块玻璃板的间隙中，至胶液面离玻璃板凹槽3 cm左右。

然后在胶液面上轻轻铺1 cm高的水（或者正丁醇），加 水时通常顺玻璃板慢慢加入，不能扰乱胶液面垂直放 置胶板于室温（25℃左右）约30 min使之凝聚此时， 在凝胶和水之间可以看到清晰的一条界面然后倒出并 吸干胶面上的水（不能损坏胶面） •醇封（或者说水封）的目的是为了使分离胶上沿平直 ，并排除气泡※凝胶聚合好的标志是胶与醇层之间形成清晰的界面 实验步骤 •3．制备浓缩胶 •浓缩胶一般用3%~5%（本实验用5%），其用量根据 实际情况而定，制备方法见表7-3将液体充分混匀 ，注入玻璃板间隙，使胶液面与玻璃板凹槽处平齐 ，而后插入“梳子”，在室温下放置20~30min，浓 缩胶即可凝聚凝聚后，慢慢取出梳子，取时应防 止把胶孔弄破取出“梳子”后，在形成的胶孔中 加入蒸馏水，冲洗未凝聚的聚丙烯酰胺等，倒出孔 中水，再加入电极缓冲液 •※样梳需一次平稳插入梳口处不得有气泡，梳底 需水平实验步骤 •将灌好胶的玻璃板垂直固定在电泳槽上，带凹槽的玻 璃板与电泳槽紧贴在一起，形成一个储液槽，向其中加 入电极缓冲液，使其与胶孔中的缓冲液相接触在电泳 槽下端的储液槽中中也加入电极缓冲液 •表7-3 5%浓缩胶配制 •胶浓度 5％ •单体母液（mL） 0.75 •去离子水（mL） 3.00 •浓缩胶缓冲液（mL） 1.25 •10％APS（μL） 40 •TEMED(μL） 12实验步骤 •4．样品制备 •（1）标准蛋白质样品的制备 • 标准蛋白质样品，可以分别单个制备，然后分别 放人不同的胶孔中，但一般是将几种标准蛋白质混合在 一起，放入一个胶孔内。

制法是称取各种标准蛋白质 0.5mg放入一个试管或1.5 m1的塑料管（Eppendorf tube)中，按0 5mg/mL的比例，加入l倍稀释的“2×样 品稀释液”，使之溶解，按每管20～100 ul分装在小试 管中，贮存冰箱中备用每次用l管，用前将小管放在 沸水浴中加热2 min，取出，冷却至室温备用 实验步骤 •（2）待测蛋白质样品制备 •固体蛋白质样品的制各方法与标准蛋白质相同 •液体状样品，如血清，则取一定量（u 1），加入 等体积的“2×样品稀释液”，混匀，然后置沸水浴 中2 min，冷却备用若待测蛋白质样品太稀可经浓 缩后再制备实验步骤 •5．加样 •加样的量不可过多或过少，过少不易检测山来，样品中至少应 含有0.25 μg的蛋白质，染色后才能检测得出，1μg的蛋白质 则十分明显了样品的点样体积根据样品溶液的浓度及凝胶孔 的大小，可在10～100 μ1之间加样前，样品在沸水中加热3 分钟，以除掉亚稳态聚合 •加样时，用微量取样器(5。