
多糖分离纯化的基本原则和方法.docx
8页本文格式为Word版,下载可任意编辑多糖分离纯化的基本原则和方法 多糖分开纯化的根本原那么和方法 多聚糖(polysaccharide),简称多糖,常由一百个以上甚至几千个单糖基通过糖苷键连接而成的,其性质已大不同于单糖,如甜味和强的恢复性已经消散,广泛存在于动物细胞膜和植物、微生物的细胞壁中,是构成生命的四大根本物质之一,与生命功能的维持紧密相关近年来,大量研究说明多糖除了有巩固免疫功能、抗肿瘤作用、抗氧化、抗衰弱、消化系统养护作用的生物学效应外,还有抗菌、抗病毒、降血糖、降血脂、抗辐射、抗凝血等作用 1、根本原那么 在不破坏多糖活性的前提下举行多糖的分开纯化尽量不引入新的杂质,或引入的新杂志易于除去,如小分子盐类可经过透析作用除去,铵根离子可通过加热挥发除去等[1] 2、分开纯化方法 多糖的生物活性倍受关注,但不少多糖的提取方法和工艺尚未成熟,基于效率、本金多方面的考虑,各种方法的开发、对比、分析是研究工作的焦点之一目前多糖提取方法主要有溶剂提取法、酸提法、碱提法、酶解法、超滤法、超声法、微波法、超临界流体萃取法首先要根据多糖的存在形式及提取部位不同,抉择在提取之前是否做预处理:提取时需留神对一些含脂较高的根、茎、叶、花、果及种子类,在用水提取前,应先参与甲醇或l:l的乙醇乙醚混合溶液或石油醚举行脱脂,而对含色素较高的根、茎、叶、果实类,需举行脱色处理。
2.1多糖的提取与分开方法 由于各类多糖的性质及来源不同,所以提取方法也各有所异,主要归纳为以下几类: 第一类 难溶于水,可溶于稀碱液的主要是胶类,如木聚糖及半乳糖等原料粉碎后用0.5mol/L NaOH水溶液提取,提取液经中和及浓缩等步骤,结果参与乙醇,即得粗糖沉淀物 其次类 易溶于温水,难溶于冷水的多糖,可用70~80℃热水提取,提取液用氯仿:正丁醇(4:1)混合除去蛋白质,经透析、浓缩后再参与乙醇即得粗多糖产物[2] 第三类 粘多糖的提取在组织中,粘多糖与蛋白质以共价键结合,故提取 时需设法破坏粘多糖与蛋白质之间的结合键通常使用蛋白酶水解蛋白片面或碱处理,使粘多糖与蛋白质之间的结合键断裂,以促进粘多糖的释放以便于提取[3] (1)碱液提取法:本法的主要依据是蛋白聚糖的糖肽键对碱不稳定原料经预处理后用0.5mol/L NaOH溶液4℃提取,提取液用酸中和蛋白质可用调pH、加热、或用白陶土吸附法除去结果以乙醇沉淀即可获得成品从软骨中提取软骨素即用此法 (2)蛋白水解酶消化法:从组织中释放出粘多糖的方法,经常使用的是蛋白水解酶举行消化。
一般应用专一性低的蛋白酶如木瓜蛋白酶及链霉素以举行广泛的蛋白质水解经酶消化后的提取液中主要还有低分子量得蛋白消化产物及残存蛋白等杂质蛋白质可用5%三氯醋酸沉淀去除,小分子的杂质可用透析法去除结果参与乙醇可得粘多糖沉淀 2.2多糖的除杂质 蛋白质的去除,通过水提所获得的粗多糖常含有较多的蛋白质采用醇沉 或其它溶剂沉淀得到的粗多糖中常含有较多的蛋白质,需要除蛋白除蛋白的方法传统上有sevage法、三氯乙酸法、酶解法、三氟三氯乙烷法等三氯乙酸法去除蛋白率高, 但多糖在三氯乙酸中不稳定,糖苷键易断裂,故多糖损失率也较高鞣酸法蛋白去除率较低,但是此种方法是利用鞣酸与蛋白质的特异性回响, 不会造成多糖的损失Sevag 法蛋白去除率最高,但是由于此法使用的试剂是氯仿和正丁醇,而氯仿是有毒物质,轻易造成多糖活性下降和溶剂残留另外, 有机溶剂与去蛋白酶结合的除蛋白法也常被用在测验研究中,其效率更高,更加节省试剂和资金为了制止使用有机溶剂可采用反复冻融的方法除蛋白 色素的去除,植物多糖提取物中含有酚类化合物,在多糖提取过程中由于氧 化作用会有色素生成,色素的存在会影响多糖的色谱分析和性质测定。
常用的脱色方法有:吸附法(DE.AE纤维素、硅藻土、活性炭等)、氧化法(过氧化氢)、离子交换法 除小分子杂质,小分子杂质如低聚寡糖的残留往往影响多糖的生物活性, 需要进一步脱除,提高纯度传统的方法是透析法,该法操作简朴、技术成熟,但周期长,往往需要2 d-3 d,常温下操作有可能造成多糖的霉变,必要时需参与少量防腐剂或需在低温条件下举行随着膜分开技术的进展,纤维滤器透析法已经进展起来了,它利用不同孔径的膜使大小不同的分子分级,这种方式可缩短生产周期,而且条件温柔,无疑是多糖脱除杂质的一条新途径 2.3多糖的纯化方法 多糖的纯化方法好多,须根据条件适选中择必要时可使用多种方法以达成梦想的分开结果 1.分级沉淀法 用乙醇举行分级分开是分开多糖混合物的经典方法,并 且适用于大规模分开该法往往需要屡屡重复举行才能达成较好的效果如从肝素生产废弃物中分开纯化硫酸皮肤素[4]分级沉淀有机试剂的筛选有机试剂沉淀法作为纯化生物大分子物质的一种经典方法,选择有机溶剂时应能和水混溶,使用较多的有机溶剂如乙醇、丙醇、丙酮等,为制止生物活性大分子变性失活,沉淀应在低温下举行。
分别选取乙醇、丙醇和丙酮作为沉淀剂,取预处理后的样品按固液比1∶10 溶解于去离子水中,参与0.1V 体积的沉淀剂,摇匀20min,4℃ 密封静置24h离心12000r /min,20min,4 ℃,取出沉淀并用20mL 去离子水冲洗、冻干再向上清液中参与0.1V 原溶液体积的沉淀剂,重复上述操作,直至参与沉淀剂时连续5 次无沉淀产生取各次沉淀溶解后举行醋酸纤维素薄膜电泳检测 2.季铵盐络合法 粘多糖的聚阴离子与某些外观活性物质,如十六烷 基三甲基溴化铵中的季铵基阳离子结合生成季铵络合物这些络合物在低离子强度的水溶液中不溶解当离子强度增大时,这些络合物可以解离并溶解本法的优点是既适用于测验室又适用于生产季铵盐及其氢氧化物是一类乳化剂,可与酸性糖形成不溶性沉淀,常用于酸性多糖的分开当溶液的pH值增高或参与硼砂缓冲液使糖的酸度增高,也会与中性多糖形成沉淀常用的季铵溴化物 (cetyltri.methyl ammonium bmmide,cTAB)及其氢氧化物(cetyl t methyl amm0nium hydr(Jxiode,CTA一0H)和(certylpyridium hydroxide,CP一0H),其浓度一般为1% ~10% (W/V),它们可在酸性、中性、微碱性和碱性中分级沉淀分开出酸性多糖。
3. 柱层析法 3.1凝胶柱层析法:常用的凝胶有葡聚糖凝胶(Sephadex)和琼脂糖凝胶(Sepharose),以不同浓度的盐溶液和缓冲溶液作为洗脱剂,使各种多糖得以分开纯化,但不适合粘多糖的分开 3.2离子交换层析 常用的交换剂为DEAE-纤维素、DEAE-葡萄糖凝胶(DEAE—Sephadex)、DEAE-琼脂糖凝胶(DEAE-Sepharose),此法适用于分开各种酸性、中性多糖和粘多糖最常用的是DEAE-纤维素在pH为6时酸性多糖吸附于交换剂上,中性多糖不吸附,然后用逐步提高盐浓度的洗脱液举行洗脱进而达成分开它一方面可纯化多糖,另一方面还可分开各种多糖如川芎多糖的分开纯化[5]:纤维素柱水平衡后,取200mg粗多糖样品溶解于蒸馏水中上样,蒸馏水洗脱70ml后,以0~3mol/l NaCl溶液梯度洗脱,流速1.0ml/min,每管收集2ml,硫酸-苯酚法显色检测 凝胶柱层析和离子交换层析往往在分开纯化过程中交替使用,以达成更好的分开纯化效果如灰树花多糖GFP75-2-2B[6]的分开: 4.超滤法 去除小分子杂质 采用中空纤维超滤膜,对多糖去蛋白质后的提取液通过超滤 5.色谱法 色谱法是常用的纯化多糖的方法,包括离子交换色谱和凝胶 色谱,色谱法是利用填料对不同种类的糖吸附作用的差异,使混合物中各糖分达成彼此分开的方法。
逆流色谱(Countercurrent chromatography,CCC)技术是一种无固体载体的连续液—液调配色谱技术,其固定相通过重力场和离心力场作用被留存在分开柱内,滚动相与固定相在色谱仪内举行调配,而达成物质的分开逆流色谱与传统色谱相比具有无死吸附、进样量大、分开纯度高等显著的优势,在食品、生物化工、制药等领域具有广阔的应用前景在海带多糖[7]的分开纯化中使用了该技术用泵把固定相从进口注入HSCCC分开柱中,待固定相弥漫后,开动主机,调理转速达成预定转速并稳定后,用20ml固定相溶解0.15g精制多糖,用恒流泵将样品溶液以确定流速注入HSCCC,片面收集器收集分开完成后,中断转动用气泵使HSCCC中的液体流出使用了逆流色谱分开多糖的双水相系统,在PEG1000浓度为12%,KH2PO4浓度为8%,K2HPO4 浓度为8%,转速在400r/min时,可以使海带多糖达成很好的分开下图为逆流色谱仪示意图 6.制备性区带电泳 同可用电泳法举行分开 7.固定化凝集素的亲和层析法 近年来根据凝集素能专一地、可逆地与游离的和复合糖中的单糖和寡糖结合的性质,利用固定化凝集素亲和层析作为分开纯 根据各种多糖的分子大小,外形及其所带电荷的不 — 8 —。
