IVF实验室的基本操作.ppt

IVF实验室的室的基本操作基本操作实验室操作原室操作原则 防止防止 污染污染配子标本的配子标本的标记；标记；受精、胚胎受精、胚胎移植；移植； 两人核对两人核对毒性测试；毒性测试；培养液、耗材培养液、耗材的使用；的使用；实验室的质量实验室的质量控制和管理控制和管理无误无误无菌无菌无毒无毒辅助生殖技助生殖技术基本操作基本操作配子、胚胎培养系统配子、胚胎培养系统1配子的收集和处理配子的收集和处理2体外受精技术体外受精技术3胚胎培养和移植胚胎培养和移植4胚胎冷冻和解冻胚胎冷冻和解冻5培养液的准培养液的准备v培养液的基本组分培养液的基本组分§无机盐离子无机盐离子------维持维持pHpH和渗透压和渗透压§碳水化合物碳水化合物------能量来源能量来源§蛋白质来源蛋白质来源§抗生素抗生素v矿物油矿物油§有利于维持培养液温度、有利于维持培养液温度、pHpH值和渗透压稳定值和渗透压稳定§防护屏障，减少污染防护屏障，减少污染§吸收脂溶性毒素吸收脂溶性毒素§防止液体蒸发防止液体蒸发培养液的准培养液的准备￿ ￿取卵前一日下午取卵前一日下午进行行v原则：高效、方便、安全、经济原则：高效、方便、安全、经济 v四孔培养皿四孔培养皿—卵卵v处理精液所需培养液处理精液所需培养液v微滴培养微滴培养—受精卵、胚胎受精卵、胚胎v胚胎移植液胚胎移植液37 ℃℃，， 5% 或或 6%CO2培箱内培箱内 平衡过夜平衡过夜卵母卵母细胞的胞的获取取v注射注射hCGhCG后后36-3836-38小时取卵小时取卵v阴阴道道超超声声探探头头引引导导下下经经阴阴道穿刺抽吸卵泡道穿刺抽吸卵泡v核对姓名核对姓名v解解剖剖显显微微镜镜下下辨辨认认卵卵冠冠丘丘复合物复合物OCCCOCCCv37℃, 537℃, 5－－6%CO6%CO2 2 培养培养 v操作迅速，避光操作迅速，避光精液精液处理理v正常精液：同正常精液：同IUIIUIv极度少精：增加离心力极度少精：增加离心力v死精症：低渗肿胀实验死精症：低渗肿胀实验v附睾穿刺精子：附睾穿刺精子：v睾丸穿刺或活检精子：睾丸穿刺或活检精子： 1ml1ml注射器针头挑碎组织，离心悬液注射器针头挑碎组织，离心悬液v附睾、睾丸精子的冷冻附睾、睾丸精子的冷冻常常规受精受精 取卵后取卵后4-8h 适应症：精液正常，适应症：精液正常， 轻度少、弱精症轻度少、弱精症受精率：受精率：65－－80％（％（MII卵）卵）受精时间：长受精、短受精受精时间：长受精、短受精卵母卵母细胞胞浆内内单精子精子显微注射微注射v适应症：严重少弱精、梗阻性无精、畸精症、既适应症：严重少弱精、梗阻性无精、畸精症、既往往IVFIVF常规受精失败史、某些不明原因不孕等常规受精失败史、某些不明原因不孕等v时间：取卵后时间：取卵后2 2小时小时v剥卵：利用透明质酸酶（剥卵：利用透明质酸酶（80mIU/ml)80mIU/ml)和机械法剥除和机械法剥除颗粒细胞颗粒细胞卵母细胞浆内单精子显微注射v卵母细胞成熟度的评价卵母细胞成熟度的评价GVMIMII￿￿￿￿卵母卵母细胞胞浆内内单精子精子显微注射微注射v操作滴的准备：操作滴的准备：7 7％％PVP PVP v加精加精v装针装针v显微注射显微注射 v受精率：受精率：7070％％受精方式的受精方式的选择vICSIICSI的安全性？的安全性？ 逃避了自然选择过程逃避了自然选择过程 垂直传递遗传缺陷垂直传递遗传缺陷 操作过程对配子的损伤操作过程对配子的损伤v严格掌握严格掌握ICSIICSI适应症适应症非男性因素不孕非男性因素不孕ICSI治疗结局治疗结局非男性因素不孕症，非男性因素不孕症，ICSI未显现出优势未显现出优势检查受精受精v时间：受精后时间：受精后1515－－1818小时小时v机械法除去颗粒细胞及放射冠机械法除去颗粒细胞及放射冠v正常受精：两个原核，两个极体正常受精：两个原核，两个极体合子形合子形态评价价v原核的大小、位置及方向原核的大小、位置及方向v核仁前体的数目、大小、分布核仁前体的数目、大小、分布v胞浆的外观胞浆的外观v早期卵裂情况早期卵裂情况异常受精－异常受精－1PNv发生率发生率 1 1－－5 5％％ 卵裂率卵裂率 74%74% 染色体二倍体率染色体二倍体率 5 5％％ 囊胚形成率囊胚形成率 29% 29% (Noyes 2008)(Noyes 2008)v机制：机制： 雌雄原核发育不同步雌雄原核发育不同步 雌雄原核融合雌雄原核融合 孤雌来源孤雌来源 ICSIICSI多见多见异常受精－多异常受精－多PNv发生率：发生率：IVF 5-8% IVF 5-8% ICSI 1% ICSI 1%v发生机制：发生机制： 2 2精子进入精子进入 第第2 2极体滞留极体滞留 双倍体卵母细胞双倍体卵母细胞未未见原核－未受精原核－未受精v可能机制可能机制 卵母细胞未成熟卵母细胞未成熟 卵母细胞染色体异常卵母细胞染色体异常v卵裂率卵裂率 <10%<10% 染色体二倍体率染色体二倍体率 3%3% 优胚率低优胚率低 (12/38) (12/38) 囊胚形成囊胚形成 (0/12) (0/12) (Noyes 2008)(Noyes 2008) 受精失受精失败v受精率受精率<20% <20% 受精率低下受精率低下 所有成熟卵均未受精所有成熟卵均未受精 受精失败受精失败v常规受精周期常规受精周期 失败率失败率 1010％％ 精子功能障碍精子功能障碍 卵母细胞成熟障碍卵母细胞成熟障碍 补打补打ICSI?ICSI?vICSIICSI周期周期 失败率失败率 2 2－－3 3％％ 严重精子畸形严重精子畸形 卵母细胞激活卵母细胞激活 钙离子载体？机械激活？钙离子载体？机械激活？ 胚胎培养胚胎培养胚胎胚胎质量量评价价v胚胎评价标准胚胎评价标准 细胞数细胞数 碎片碎片: :无碎片无碎片 碎片碎片<10% <10% 碎片碎片1010－－3030％％ 碎片碎片3030－－5050％％ 碎片碎片>50%>50% 卵裂球均匀程度卵裂球均匀程度 囊胚的囊胚的评分体系分体系4AA4AA囊胚腔的大小囊胚腔的大小内细胞团细胞分级内细胞团细胞分级滋养层分级滋养层分级三位评分法三位评分法1:1:不到整个胚胎的一半不到整个胚胎的一半2 :2 :超过了胚胎体积的一半超过了胚胎体积的一半3 :3 :完全占据整个胚胎完全占据整个胚胎4:4:扩张囊胚扩张囊胚5:5:孵化囊胚孵化囊胚 6:6:孵化后囊胚孵化后囊胚A A包裹紧密，大量细胞包裹紧密，大量细胞B B结构松散，少量细胞结构松散，少量细胞C C极少量细胞极少量细胞A A许多细胞紧密结合许多细胞紧密结合B B少量细胞，结构松散少量细胞，结构松散C C极少量细胞极少量细胞 2AA5AA 4BA4CC胚胎移植操作胚胎移植操作v选择需要移植的胚胎选择需要移植的胚胎, ,移入移植滴内移入移植滴内 3535岁以下，首次移植的病人移植岁以下，首次移植的病人移植2 2枚胚胎枚胚胎 3535岁以上，或非首次移植的病人移植岁以上，或非首次移植的病人移植3 3枚胚胎枚胚胎v确认核对患者姓名确认核对患者姓名vD3 or D5 D3 or D5 移植？移植？移植液移植液移植液移植液移植液和胚胎移植液和胚胎气气～ 20μl气气胚胎移植操作胚胎移植操作胚胎冷胚胎冷冻v意义：提高累计妊娠率，避免多胎，减少卵巢过度意义：提高累计妊娠率，避免多胎，减少卵巢过度刺激风险刺激风险v温度的急剧变化形成冰晶温度的急剧变化形成冰晶 机械性损伤机械性损伤 溶质性损伤溶质性损伤 渗透压损伤渗透压损伤 核心：避免冰晶形成核心：避免冰晶形成v冷冻方法：慢冻速融法冷冻方法：慢冻速融法 玻璃化冷冻法玻璃化冷冻法v冷冻保护剂冷冻保护剂 渗透性保护剂：渗透性保护剂：EG PRON EG PRON 甘油甘油 非渗透性保护剂：蔗糖非渗透性保护剂：蔗糖 大分子物质大分子物质胚胎的冷冻胚胎的冷冻:慢速冷冻慢速冷冻室温室温 15min室温室温 5min室温室温15minPBS1.5M丙二醇丙二醇丙二醇蔗糖丙二醇蔗糖慢慢冻速融法速融法v冷冻程序冷冻程序 2 20℃→0℃→－－7℃ 3℃/min7℃ 3℃/min -7℃ -7℃ 人工植冰人工植冰 -7℃→-7℃→－－30℃ 0.3℃/min30℃ 0.3℃/min -30℃→ -30℃→－－120℃ 30℃/min120℃ 30℃/min胚胎复胚胎复苏1234丙二醇丙二醇蔗糖蔗糖 5min蔗糖蔗糖 5minPBS 5min丙二醇丙二醇蔗糖蔗糖 5min 预防冰晶的再形成预防冰晶的再形成 复苏程序：复苏程序： 室温室温 40s→ 30℃℃水浴水浴 1min胚胎胚胎冻融融损伤v复苏胚胎评价：复苏胚胎评价：>50%>50%卵裂球完整卵裂球完整 存活存活 复苏率复苏率>90%>90%v无损伤胚胎着床率高无损伤胚胎着床率高 部分损伤胚胎着床能力下降部分损伤胚胎着床能力下降玻璃化冷玻璃化冷冻v原理原理v条件：高浓度冷冻保护剂条件：高浓度冷冻保护剂 极快的降温速度极快的降温速度v载体：开放式载体：开放式 密闭式密闭式v适应症：卵母细胞适应症：卵母细胞 囊胚囊胚v优点：复苏率高优点：复苏率高其他技其他技术-IVMv未成熟卵母细胞体外成熟（未成熟卵母细胞体外成熟（IVMIVM））v优点：简便优点：简便 经济经济 避免避免OHSSOHSSv体外培养体外培养24-48h24-48hvIVMIVM培养液培养液IVM临床效果床效果评价价v新鲜移植新鲜移植 临床妊娠率临床妊娠率v流产率流产率v累计妊娠率累计妊娠率v安全性？安全性？。