石蜡切片组织RNA提取.ppt

ANNUALBUSINESSREVIEW从从石蜡切片组织中提取石蜡切片组织中提取RNARNA董进曲董进曲/ Jinqu Dong2013.12.26- 2 -概览概览有关石蜡组织切片样品处理试剂及仪器RNA 质控RNA 提取RNA 质控补：DNA石蜡组织切片电泳定量- 3 -有关石蜡切片有关石蜡切片§石蜡切片（paraffin section）： 组织学常规制片技术中最为广泛应用的方法石蜡切片不仅用于观察正常细胞组织的形态结构，也是病理学和法医学等学科用以研究、观察及判断细胞组织的形态变化的主要方法，而且也已相当广泛地用于其他许多学科领域的研究中教学中，光镜下观察切片标本多数是石蜡切片法制备的活的细胞或组织多为无色透明，各种组织间和细胞内各种结构之间均缺乏反差，在一般光镜下不易清楚区别出；组织离开机体后很快就会死亡和产生组织腐败，失去原有正常结构，因此，组织要经固定、石蜡包埋、切片及染色等步骤以免细胞组织死亡，而能清晰辨认其形态结构- 4 -有关石蜡切片有关石蜡切片§石蜡切片法包括取材、固定、洗涤和脱水、透明、浸蜡、包埋、切片与粘片、脱蜡、染色、脱水、透明、封片等步骤一般的组织从取材固定到封片制成玻片标本需要数日，但标本可以长期保存使用，为永久性显微玻片标本。

- 5 -Ambion1975- 6 -石蜡组织切片石蜡组织切片R RNANA提取：提取：实验原理二甲苯二甲苯& &Ambion1975Ambion1975试剂盒试剂盒：：§ 蛋白酶K：消化与RNA结合的组蛋白关键点：关键点：§ 二甲苯：溶解并去除石蜡通过二甲苯的去蜡以及蛋白酶K使RNA从石蜡组织中裂解释放，并通过DNA吸附柱有效提取RNA.后续分析困难受破坏RNA（固定步骤）降低RNA 得率§ 注：RNA降解- 7 -内容内容1、样品处理2、RNA抽提有关石蜡组织切片样品处理试剂及仪器RNA 质控RNA 提取RNA 质控补：DNA石蜡组织切片电泳定量- 8 -样品处理样品处理§存放位置, 使用情况, 是否返还§样品移交记录（实验室间） Ø实验室信息管理系统ØMicrosoft Excel Ø手写记录组织蜡块 切片 提取及质检 RNA 实验/数据- 9 -R RNANA提提取取前前组织蜡块 切片 提取及质检 RNA 实验/数据1.1 实验前的准备工作1.1.1 打开超净台的紫外灯，灭菌15min，然后通风10min。

1.1.2 在第一次使用Wash1和Wash2/3之前，按照下列步骤加入无水乙醇：加入42mL的无水乙醇（如试剂瓶上所示）至Wash1中，充分混匀，即为工作液；加入48mL的无水乙醇（如试剂瓶上所示）至Wash2/3中，充分混匀，即为工作液1.1.3 用镊子将刀片蘸取少量酒精，酒精灯上灼烧刀片，冷却后备用- 10 -1.1.石蜡组织切片收集石蜡组织切片收集 及鉴定及鉴定2.2.组织切片刮取组织切片刮取3.3.去除石蜡去除石蜡4.4.裂解消化裂解消化DNADNA5.5.消化消化DNADNA与收集与收集RNARNA 每个样本以约300ul的石蜡组织切片量为宜.使用一次性解剖刀从组织片中刮取石蜡组织至离心管中，尽量防止组织碎片飞散造成交叉污染.通过蛋白酶消化组蛋白,消化裂解3h加入4µL蛋白酶，）使用Ambion1975纯化柱收集石蜡组织切片石蜡组织切片R RNANA提取步骤提取步骤向含有石蜡组织的离心管中加入二甲苯，通过二甲苯溶解石蜡并去除，再用无水乙醇去除二甲苯 - 11 -R RNANA提提取取前前1.2 操作步骤1.2.1 石蜡包埋组织样品的预处理1.2.1.1. 取石蜡块和一张干净的称量纸，使用冷却后的洁净刀片将组织轻轻刮下来，刮片厚度不大于50µm，尽量避免刮下石蜡。

注意： 切取石蜡组织块的时候，组织碎屑越薄越好，并且尽可能少地切取石蜡块1.2.1.2. 将刮取的组织小心地转移至干净的1.5ml 离心管中，至总体积约为300 µL1.2.1.3. 如果样品为石蜡切片，可以直接进行后续的脱蜡处理，但是建议5-20µm石蜡卷量不要超过总厚度80µm：即5µm切片取16片，而20µm切片取4片注意：如果需要进行miRNA实验，石蜡切片厚度应不低于10µm - 12 -3. 3. R RNA NA 抽提抽提1.2.2 二甲苯脱石蜡1.2.2.1. 加入1ml 二甲苯，至上述离心管中，盖紧盖子，剧烈震荡混匀5min；瞬时离心，将附着在管壁的组织收集至管底；50℃，3min，离心机最大转速室温离心2min，弃上清注意： 二甲苯有毒，应尽量在通风橱中开盖操作，以减少实验室空气污染1.2.2.2. 观察形成的组织沉淀是否很紧实，如果异常，重复观察形成的组织沉淀是否很紧实，如果异常，重复1.2.2.1实验操作实验操作1.2.2.3. 加入1ml无水乙醇至离心管中，剧烈震荡混匀2min，离心机最大转速（13200rpm)室温离心2min，小心弃上清；重复此步骤一次- 13 -3. 3. R RNA NA 抽提抽提1.2.2.4. 弃上清，室温短暂离心，用移液器将剩余的无水乙醇吸出。

1.2.2.5. 真空旋转浓缩仪干燥组织中残余乙醇（5min)，45℃，浓缩时间＜20min；如果室温晾干组织沉淀，时间为15-45 min1.2.3 蛋白酶消化 - 14 -3. 3. R RNA NA 抽提抽提1.2.3.2 加入4μL Protease后，上下颠倒混匀，如果组织附着在管壁上，用枪头或瞬时离心使组织浸入到裂解液里1.2.3.3 置于恒温金属浴中孵育，50℃，500rpm摇动3h；然后70℃，500rpm摇动20min注意：如果延长注意：如果延长70℃反应时间，有可能导致反应时间，有可能导致RNA降解，故不要降解，故不要随意延长时间随意延长时间- 15 -3. 3. R RNA NA 抽提抽提1.2.4 总核酸提取1.2.4.2 混匀，吸取700µL混合液至过滤柱里，为放止堵住过滤柱，避免吸到大块未被消化掉的组织块到过滤柱里，然后10,000g，30s，弃滤液至原管1.2.4.3 加700µL Wash1至Filter Cartridge上，10,000g，30s，弃滤液- 16 -3. 3. R RNA NA 抽提抽提1.2.4.4 加500µL Wash2/3至Filter Cartridge上，10,000g，30s，弃滤液。

1.2.4.5 空甩，10,000g，30s，，去除残留洗液1.2.5 DNA酶消化和RNA分离纯化- 17 -3. 3. R RNA NA 抽提抽提1.2.5.2 加入60µLDNase mix至每个Filter Cartridge中心，盖上管盖，室温孵育30min1.2.5.3 加700µL Wash1至Filter Cartridge上，室温孵育30-60s后，10,000g，30s，弃滤液1.2.5.4 加500µL Wash2/3至Filter Cartridge上，10,000g，30s，弃滤液；1.2.5.5 重复一次4.2.5.4操作后，10,000g，空甩1min1.2.5.6 将Filter Cartridge转入另一新Collection Tube管中，加60µL Elution Solution到滤膜中心，盖上管盖室温静置1min后，最大转速1min1.2.5.7 进行Nano Drop RNA定量，如果不马上定量，将样品保存于-80℃- 18 -§ 使用二甲苯脱蜡，去蜡更完全，但二甲苯有毒；注意事项注意事项§ 观察脱蜡后形成的组织沉淀是否很紧实，如果异常，重复脱蜡;§ 真空旋转浓缩仪干燥组织中残余乙醇,充分干燥影响下一步消化;§ 电泳：用DEPC水清洗，及配胶（加甲醛）;- 19 -控制交叉污染控制交叉污染必须严格控制样品间交叉污染Ø一个样品用一个解剖刀片Ø实验前后清洁工作区Ø经常换手套Ø无PCR产物区域Ø尽量防止组织碎片飞散造成交叉污染- 20 -试剂、仪器及耗材试剂、仪器及耗材- 21 -试剂、仪器及耗材试剂、仪器及耗材- 22 -试剂、仪器及耗材试剂、仪器及耗材- 23 -Thanks！。