实验3 酵母蔗糖酶的制备.doc

实验实验 3 3 酵母蔗糖酶的制备酵母蔗糖酶的制备一、实验目的一、实验目的1、学习、掌握提取啤酒酵母中的蔗糖酶2、学习用紫外分光光度法测定蛋白质含量二、实验原理二、实验原理蔗糖酶催化蔗糖水解成为果糖和葡萄糖的一种酶，广泛存在于动植物和微生物中，主要从酵母中得到，特异地催化非还原糖中的 α—呋喃果糖苷键水解，具有相对专一性不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成密二糖和果糖啤酒酵母中含有大量的蔗糖酶，通过研磨破细胞壁，使酶游离出来，用水萃取酶，然后用有机溶剂沉淀酶蛋白得到粗制品，还可用柱层折进一步纯化得到精制品三、实验器材三、实验器材1、试剂：二氧化硅、去离子水(使用前冷至 4℃左右)、冰块、食盐、1mol/L 乙酸、95％乙醇2、材料：啤酒酵母、3、仪器：研体、恒温水浴锅、高速冷冻离心机四、实验步骤四、实验步骤1 研磨水提取(1)准备一个冰浴，将研钵稳妥地放入冰浴中2)称取 1g 啤酒醉母和适量(约 5mg)二氧化硅一起放入研钵中，二氧化硅要预先研细3)缓慢加入预冷的 30m1 去离子水．每次加 2m1 左右，边加边研磨．至少用 30 分钟，至酵母细胞大部分研碎，将蔗糖酶充分转入水相。

4) 将混合物转入离心管中，平衡后．用高速冷冻离心机离心，4℃，10000r／min，离心15min5) 用滴管小心地取出水相，转入另一个清洁的离心管中，4℃，10000r／min，离心15min6) 将上清液转入量筒，量出体积用广泛 pH 试纸检查上清液 PH，用 lmol/L 乙酸将 pH 调至 5.0，称为“级分 I”级分 I 总共量了 28ml）留出 5m1 测定酶活力及蛋白含量，剩余部分转入清洁离心管中2 热处理和乙醇沉淀(1)预先将恒温水浴调到 50℃，将盛有级分 I 的离心管稳妥地放入水浴中，50℃下保温 30min,在保温过程中不断轻摇离心管2)取出离心管，于冰浴中迅速冷却，4℃．10000r／min，离心 10min 3)将上清液转入小烧杯中，放人冰盐浴(没有水的碎冰撒入少量食盐)，缓慢地加入等体积预冷至—20℃的 95％乙醇，同时轻轻搅拌．再在冰盐浴中放置 l0min、以沉淀完全于 4℃、10000r／min，离心 10min,倾去上清液，并滴干，沉淀保存于烧杯中，盖上盖子或薄膜封口，然后将其放人冰箱中冷冻保存(称为“级分Ⅱ )3 紫外吸收法测定蛋白质（1）取待测样品（本实验提取的级分 1 和级分Ⅱ）置于石英比色皿中，紫外分光光度计280nm 和 260nm 出测定 OD，用去离子水作为空白对照；（2）根据下列公式计算样品中蛋白质含量蛋白质含量（mg/ml）=1.55 OD280-0.76 OD260五、实验思考五、实验思考1. 为什么酶的提取需要低温操作?2．热处理的目的是什么？实验实验 4 4 蔗糖酶的活性和比活力测定蔗糖酶的活性和比活力测定一、实验目的一、实验目的1、掌握酶活性测定的方法和原理2、测定级分Ⅰ、Ⅱ的酶活性，学习酶比活力计算。

二、实验原理二、实验原理1、蔗糖＋蔗糖酶（水解酶）→D-果糖＋Ｄ－葡萄糖用测定生成还原糖（葡萄糖和果糖）的量来测定蔗糖水解的速度本实验中，蔗糖酶的活力单位指在一定条件下反应５min,每产生１mg 葡萄糖所需的酶量２、DNS 试剂＋Ｄ－葡＋强碱液中＋沸水浴生成氨基化合物（棕红色）三、实验器材三、实验器材1、试剂：葡萄糖 2mol/L、蔗糖 0.2mol/L、1mol/LNaOH、DNS 试剂：酒石酸钾钠 18.2g,溶于 50ml 蒸馏水中，加热（不超过 50℃） ，于热溶液中依次加入 3，5-二硝基水杨酸 0.63g， ，NaOH 21.0g，苯酚 5.0g，无水亚硫酸钠5.0g，搅拌至溶解完全，冷却后用蒸馏水定容至 1000mL，贮存于棕色瓶中，室温保存2、仪器：分光光度计、水浴锅3、材料：实验 3 所得级分Ⅰ、Ⅱ的蔗糖酶四、实验方法四、实验方法1．工作曲线的制作取６只试管，按下表加入 2.0mg∕ml 葡萄糖标准液和蒸馏水管号管号 葡标准液葡标准液∕ml∕ml 蒸馏水蒸馏水∕ml∕ml 葡含量葡含量∕(mg.ml∕(mg.ml)-1)-1 １１ ００ １１ ００２２ 0.20.2 0.80.8 0.40.43 3 0.40.4 0.60.6 0.80.84 4 0.60.6 0.40.4 1.21.25 5 0.80.8 0.20.2 1.61.66 6 1.01.0 0 0 2 2 在上述试管中＋ＤＮＳ试剂２ml，沸水浴５min，流动水迅速冷却，各加蒸馏水９ml，摇匀，在 540nm 波长测光吸收值，以葡含量（mg∕ml）为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。

2．酶液的稀释（级分酶液的稀释（级分ⅠⅠ、级分、级分ⅡⅡ））各取 0.2ml 稀释 10 倍，得到 2ml 稀释液3．吸光度的测定吸光度的测定取２ml 稀释后的酶液＋２ml 0.2mol∕L 蔗糖，立即摇匀开始计时，35℃水浴５min,立即加入１ml1mol/LNaOH 中止反应取 1ml 的反应液＋２ml DNS 试剂，沸水浴５min，立即用流动的自来水冷却后，加入９ml 蒸馏水，进行吸光度的测定4 4．计算酶的活力．计算酶的活力 稀释后的酶活力→原始酶活力（1）酶活力计算：在室温、pH4.5 条件下，每分钟水解产生 1μmol 葡萄糖 所需的酶量，定义为酶的 1 个活力单位（U）（2）计算级分Ⅰ、级分Ⅱ的比活力比活力= 酶活力/1ml 蛋白质的含量注意事项：水浴温度，时间要精确注意事项：水浴温度，时间要精确五五 实验思考实验思考1、什么是比活力？测定比活力的意义是什么？2、试分析级分Ⅰ、级分Ⅱ的比活力的高低和原因。