基于miR528靶向水稻光温敏核不育系HD9802S的候选不育基因HDtms.doc

分类号： 学校代号：10512学 号： 秘密☆ 年直接填写相应的密级和保密期限，字体为四号黑体公开论文此处为空湖北大学硕士学位论文（论文题名和副题名）作者姓名：朱丽娜 指导教师姓名、职称：居超明 副教授申请学位类别：硕士学位 学科专业名称：遗传学研究方向：植物遗传学论文提交日期： 年 月 日 论文答辩日期： 年 月 日学位授予单位：湖北大学 学位授予日期： 年 月 日答辩委员会主席： 论文题目Application of the Wavelet Analysis inthe Fault Diagnosis of Rotating Machines“硕士学位论文”字 样A Thesis Submitted for the Degree of Master作者姓名、指导教师姓名Candidate：Zhu LinaSupervisor：Prof. Ju ChaomingHubei University Wuhan, China湖北大学学位论文原创性声明和使用授权说明原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。

除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担论文作者签名： 日期： 年 月 日学位论文使用授权说明本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，并提供目录检索与阅览服务；学校可以允许采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存学位论文；在不以赢利为目的的前提下，学校可以公开学位论文的部分或全部内容保密论文在解密后遵守此规定）作者签名： 日期：指导教师签名： 日期：摘 要光温敏核不育水稻是一种珍贵的种质资源，为了能更好的利用该资源，必须对光温敏核不育水稻的不育基因的遗传机理及分子生物学方面进行广泛深入的研究目前知道光温敏核不育基因的分布非常广泛，在不同的光温敏核不育系中表现出较大的差异实验室前期的研究结果显示：该不育系HD9802S的育性受一对主效隐性基因控制，且将该不育基因定位位于水稻第二号连锁群上的SSR分子标记RM5897和RMAN8之间，进一步精细定位于第二号连锁群上的SSR分子标记RM12729和RM12732之间。

将RM5897和RMAN8之间的约50K的物理距离称作光温敏核不育系水稻HD9802S候选不育基因HDtms在BGI Rise Genome Database数据库中检索到位于RM5897和RMAN8之间的序列（编号为Scaffold002359），运用Fgenesh软件预测Scaffold002359之间的可能存在的基因，并成功预测了3个基因7个编码区，对7个编码区分别运用amiRAN靶的设计原则设计了21个干扰的靶位点本研究中amiRAN双元表达载体的构建是分两步来进行的首先是供体载体的构建：光温敏核不育系水稻HD9802S的候选不育基因HDtms的7个编码区21个靶位点的序列，利用PCR技术将该7个编码区的21个靶位点分别替换miR528的靶位点，而侧翼及环的结构与miR528保持一致，使其转录后RNA结构类似于miR528结构其次是amiRAN双元表达载体的构建：将测序正确的中间载体通过结合转移mating-assisted genetically integrated cloning（MAGIC）将目标表达单元转移到双元表达载体，并通过电转法转入农杆菌EHA105中为了能够进一步探索候选不育基因HDtms的精确位置和功能，我们将构建好的双元amiRNA表达载体通过农杆菌介导的方法转入模式籼稻9311中，目前带有抗性的水稻小苗已经分化出了，对其相关性状的研究有待进一步的验证。

关键词：水稻 amiRAN表达载体 转基因 PCR 光温敏核不育基因AbstrackKey Words：目 录第一章 文献综述 11.1 光温敏不育水稻的研究概况 11.2 miRNA干扰研究概述 31.2.1 miRNA的发现 31.2.2 miRNA的发生及作用机制 41.2.3 人工miRNA的概述 71.2.4 siRNA和miRNA作用机制的关系 81.3 构建质粒克隆载体的基本策略 91.4 后基因组学研究概述与基因功能研究方法 101.4.1 后基因组学概述 101.4.2 后基因组研究的内容及方法 101.5 植物的遗传转化及基因功能研究 101.5.1 植物转基因的研究进展 111.5.2 基因功能研究 111.6 本研究的目的和意义 13第二章 材料和方法 142.1 供试材料 142.1.1 水稻材料及质粒和菌株 142.1.2 实验培养基 152.1.3 主要试剂和仪器 152.2 试验方法 152.2.1 HD9802S候选不育基因HDtms人工miRNA表达载体的构建 152.2.2 籼稻9311愈伤的转化 21第三章 结果与分析 273.1 一步PCR法获得amiRNA表达单元的供体载体结果分析 273.2 amiRNA表达单元从供体载体转移到受体双元载体的设计原理图 303.3 整合了amiRNA表达单元的双元载体p1301-HDtms的重组子检测 323.4 农杆菌介导的籼稻转基因 333.4.1 p1301-HDtms双元载体转化农杆菌 333.4.2 籼稻9311转基因操作简单流程图 343.5 转基因籼稻9311的阳性检测 353.5.1 转基因植株基因组DNA 363.5.2 转基因植株潮霉素基因PCR检测 36第四章 讨论 384.1 水稻温敏核不育系HD9802S候选不育基因HDtms的amiRNA干扰靶序列的设计 384.2 amiRNA双元表达载体的构建策略 384.3 基于LY培养基来进行籼稻9311转基因操作 39参考文献 41第一章 文献综述第一章 文献综述1.1 光温敏不育水稻的研究概况水稻是全世界第二大粮食作物，世界种植水稻的国家和地区有122个，其中亚洲占88.86%，美洲占6.43%，非洲占3.92%，欧洲占0.72%，大洋洲占0.08%。

水稻生产的丰歉直接影响和决定我国粮食供应和人民的生活水平根据我国人口不断增加而耕地面积逐年递减的事实，只有不断地提高粮食的产量，才能解决人类生存的粮食供应问题21世纪人类面临着环境、资源和人口的巨大挑战，据国际水稻研究所(IRRI)的估计，消费水稻的人口每年以1.8%的速度递增，到2020年，世界人口将增至80亿，消耗大米的人数将可能比现在增加一倍到2025年，水稻的年产量必须从现在的每年5亿6000万吨提高到8亿5000万吨，稻谷产量的增长幅度需达到74%，才能满足人口不断增长的需求而我国一半以上人口以稻米为主食，因此，提高水稻产量和质量尤为重要[1-3]在构成产量的诸多因素中，新的基因和种质资源的发掘、创造，杂种优势利用是今后粮食增产的方向和途径1926年，美国琼斯(J·W·Jones)首次提出水稻具有杂种优势1964年，袁隆平在洞庭早籼中发现水稻雄性不育株，从而开始了我国水稻雄性不育研究，并提出通过选育雄性不育系、雄性不育保持系和雄性不育恢复系的三系法途径来利用水稻的杂种优势1970年，李必湖等在海南岛崖县发现野生稻雄性不育株(简称野败)，为培育杂交水稻打开了突破口随后开展了以袁隆平为攻关主将的全国协作研究，于1973年实现三系配套，1974年选配出强优势籼型杂交水稻组合并试种成功，1975年攻克制种技术关，1976年开始大面积推广。

1973年石明松在农垦58大田中发现一株天然不育株并观察到其育性会随季节发生变化，从此揭开了水稻光温敏不育性研究和利用的新篇章据此，学者们提出，利用光温敏核不育系在长日高温条件下制种，在短日低温条件下进行繁殖，实现两系配套，无需保持系基于这一重大发现，1987年袁农平提出了杂交水稻发展由三系、两系到一系的战略设想此后通过辐射、地理远缘材料间的杂交、生物技术和杂交转育等方法选育了大批光温敏不育系在进行育种研究的同时，还对这些光温敏不育系育性的一些基本理论问题开展了研究，在理论和实践上都取得了重大成果光敏型雄性核不育是一种新的不育类型，在育种时利用这种类型的不育系比三系配套法有许多优点该项研究已被列入“863”国家高科技攻关计划，迅速进行了大规模的研究1988年8月籼型光敏核不育系W6154S、粳型光敏核不育系N5047S、3111S和WD1S通过国家级鉴定，标志着光敏核不育特征能够转育到生产上推广的籼粳品种中，两系杂交稻能够用于生产之后又在籼稻中发现了多个光敏型雄性核不育材料，以及温敏型雄性核不育材料一批实用型低温敏核不育系相继育成后，从而使籼型两系杂交稻育种获得了突破据“2004中国·怀化国际杂交水稻与世界粮食安全论坛”报道，截至2003年，全国共育成并通过省级或省级以上技术鉴定的光温敏核不育系80多个，选育两系杂交水稻组合100多个，累计种植330多万公顷。

国内外发现的光温敏核不育系水稻已有很多，比较重要的有以下几种：湖北省农业科学院石明松（1981）在NK58大田中发现天然不育株“NK58S”，以及由NK58S作不育基因供体转育而成的7001S，W6154S等，湖南杂交水稻研究中心由NK58S作不育基因供体转育而成的培矮64S；湖南安江农业学校李必湖等（1990）从超40B/H285//6209-3的F5中发现的天然不育株“安农S-1”，以及由安农S-1作不育基因供体转育而成的香125S等；湖南省衡阳市农业科学研究所周国峰等（1991），武小金等（1992）在长芒野生稻/R0183//测64后代中选育而成的“衡农S-1”；湖南亚华种业股份有限公司杨远柱等（2000），株洲市农业科学研究所杨文才等（2000）用遗传距离较远的不同生态类型材料杂交育成的籼型广亲和温敏不育系“株1S”；福建农业大学杨仁崔等（1988，1990）在IR54辐射后代5460早熟突变系中发现的“5460S”； 湖北大学 日本Maruyama等（1991）经辐射育成的H89-1（农林PL-12）；菲律宾国际水稻研究所Virmani等（1991）经辐射育成的IR32364；越南Dong等（1995）选育的TGMS-VN1[7]。

2004年，国内已报道的102份光温敏核不育系统计，农垦58 S转育的达80份，安农S-1转育的有13份和几个5460S转育的，农垦58 S、安农S-1、5460S都是自然突变株，因此，自然突变的材料无论是从种质资源还是应用方面来说都有较高。