质粒提取、定量与酶切鉴定.ppt

质粒质粒质粒质粒DNADNA的提取、定量的提取、定量的提取、定量的提取、定量与酶切鉴定与酶切鉴定与酶切鉴定与酶切鉴定Extraction and Identification of Plasmid DNA实验流程图实验流程图一、碱裂解法提取质粒一、碱裂解法提取质粒三、质粒酶切三、质粒酶切二、质粒定量二、质粒定量四、酶切产物的琼脂糖电泳检测四、酶切产物的琼脂糖电泳检测最后做最后做• 掌握碱裂解法提取质粒的方法掌握碱裂解法提取质粒的方法 • 掌握紫外吸收测定掌握紫外吸收测定DNADNA的方法的方法• 了解质粒酶切鉴定原理了解质粒酶切鉴定原理• 掌握琼脂糖凝胶电泳技术掌握琼脂糖凝胶电泳技术实验目的实验目的pMD18-T实验材料实验材料•大肠杆菌大肠杆菌DH5a菌株菌株•pMD18-T载体载体•Axygen质粒小量提取试剂盒质粒小量提取试剂盒•Takara EcoRI 限制性内切酶限制性内切酶•Takara Hind III 限制性内切酶限制性内切酶•Takara 10 × M 酶切缓冲液酶切缓冲液•BioWest电泳琼脂糖干粉电泳琼脂糖干粉•0.5×TBE核酸电泳缓冲液核酸电泳缓冲液•EB 核酸荧光染料核酸荧光染料•Takara 6 × 电泳上样缓冲液电泳上样缓冲液实验仪器实验仪器•微量移液器微量移液器•离心机离心机•恒温水浴箱恒温水浴箱•紫外检测仪紫外检测仪•电泳仪电泳仪•水平电泳槽水平电泳槽•独立于细菌染色体独立于细菌染色体以外，能独立自主以外，能独立自主复制的闭合环状复制的闭合环状DNA分子分子•基因工程常采用的基因工程常采用的载体载体一、碱裂解法提取质粒一、碱裂解法提取质粒DNA•碱裂解法碱裂解法；；•煮沸裂解；煮沸裂解；•羟基磷灰石柱层析法；羟基磷灰石柱层析法；•质粒质粒DNA释放法；释放法；•酸酚法等酸酚法等质粒提取方法：质粒提取方法：碱裂解法碱裂解法基本原理基本原理            基于染色体基于染色体DNA与质粒与质粒DNA的变性与复性的的变性与复性的                                         差异而达到分离目的。

差异而达到分离目的染色体染色体DNA：氢键断裂，：氢键断裂，变变性性质粒质粒DNA：大部分氢键断裂，：大部分氢键断裂，但超螺旋共价闭合环状的两但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离条互补链不会完全分离不完全变性）（不完全变性）质粒质粒DNA：：复性复性，溶于溶液中，溶于溶液中染色体染色体DNA：：不能复性不能复性；形成缠连；形成缠连的网状结构的网状结构 （碱性）（碱性）   NaAc溶液溶液 （）（）pH=中性中性染色体染色体DNA与不稳定的大分子与不稳定的大分子RNA、、蛋白质蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来复合物等一起沉淀下来离心离心u溶液溶液S1（细菌悬浮液）（细菌悬浮液）u裂解液裂解液S2u中和液中和液S3u去蛋白液去蛋白液W1u漂洗液漂洗液W2u洗脱液洗脱液uRNase A(100mg/ml)uDNA吸附柱吸附柱试剂盒的组成：试剂盒的组成：溶液溶液S1：：   50 mmol/L　葡萄糖　葡萄糖     10 mmol/L　　EDTA      25 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)      2毫克毫克/毫升　溶菌酶毫升　溶菌酶裂解液裂解液S2：：200 mmol/L NaOH                1% SDS中和液中和液S3：： 3 mol/L KAc (pH4.8)溶液溶液实验流程实验流程1.5mL 菌液菌液12000rpm1 min菌体沉淀菌体沉淀溶液溶液S1250μl剧烈震荡剧烈震荡裂解液裂解液S2250μl颠倒混匀颠倒混匀4-6次次中和液中和液S3350μl温和地温和地颠倒混匀颠倒混匀6-8次次12，，000rpm10 min室温静置室温静置2min至出现白色至出现白色絮状沉淀絮状沉淀取取700μl上清至上清至吸附柱管吸附柱管12，，000rpm30s12，，000rpm30s漂洗液漂洗液W2600μl12，，000rpm30s12，，000rpm2 min取吸附柱至取吸附柱至另一新另一新EP管管洗脱液洗脱液Eluent50μl12，，000rpm1 min室温静置室温静置1min弃滤液弃滤液空柱空柱收集洗脱液备用收集洗脱液备用去蛋白液去蛋白液W1600μl弃滤液弃滤液弃滤液弃滤液2. 2. 悬浮细胞悬浮细胞悬浮细胞悬浮细胞1. 1. 收集细胞收集细胞收集细胞收集细胞3. 3. 裂解细胞裂解细胞裂解细胞裂解细胞4. 4. 中和中和中和中和6. 6. 洗柱洗柱洗柱洗柱7. 7. 洗脱洗脱洗脱洗脱5. 5. 过柱分离过柱分离过柱分离过柱分离二、质粒二、质粒DNA定量测定定量测定利用核酸在利用核酸在260nm处有紫外吸收的特性处有紫外吸收的特性基本原理基本原理紫外分光光度计紫外分光光度计操作步骤操作步骤1. 取取5 l提取的质粒提取的质粒DNA，加入，加入95 l蒸馏水蒸馏水2. 混合均匀混合均匀3. 用紫外分光光度计测定用紫外分光光度计测定A260DNA或或RNA的定量的定量A260相当于相当于           50μg/ml双链双链DNA           40μg/ml单链单链DNA（或（或RNA））           20μg/ml寡核苷酸寡核苷酸紫外光吸收法紫外光吸收法：：DNA纯品纯品:  OD260/OD280 RNA纯品纯品:  OD260/OD280 DNA或或RNA的纯度判定的纯度判定数据处理样品编号样品编号质粒质粒DNA的的浓度浓度(µg/ml)123平均值平均值             Ratio值值A260/A280三、质粒三、质粒DNA的酶切分析的酶切分析•质粒质粒 DNA: ～～3 kb          载体载体: pMD18-T                                                     基因基因: CHD5         0.4 kb•限制酶特异性地结合于一段被称为限制酶特异性地结合于一段被称为限制酶识别序列限制酶识别序列的的特殊特殊DNA序列之内或其附近的序列之内或其附近的特异位点特异位点上，并在此上，并在此切切割双链割双链DNA。

•分子克隆中常用的为分子克隆中常用的为II型限制酶，其识别位点长度为型限制酶，其识别位点长度为4～～6个核苷酸的个核苷酸的反向重复序列反向重复序列限制性内切酶限制性内切酶GGATCCCCTAGGEcoRⅠ和和HindⅢ的识别序列和切口是：的识别序列和切口是：•  EcoRⅠ：：G↓AATTC•  HindⅢ：：A↓AGCTTpMD18-T反应物反应物       体积（体积（µl)10× M 酶切缓冲液酶切缓冲液          2质粒质粒DNA                                        10Hind III           1EcoR I           1H2O           6在一个洁净的在一个洁净的1.5 ml离心管中混匀下列反应物：离心管中混匀下列反应物：    混合后混合后37 ℃水浴水浴1～～2h质粒质粒DNA的酶切分析操作的酶切分析操作•影响酶切反应的因素影响酶切反应的因素底物底物DNA的纯度的纯度反应系统：反应系统：(反应缓冲液反应缓冲液)反应体积：反应体积： 甘油浓度甘油浓度<5%保温时间与温度保温时间与温度四、琼脂糖凝胶电泳四、琼脂糖凝胶电泳电泳：电泳：带电粒子在电场中泳动的现象带电粒子在电场中泳动的现象影响迁移率的因素？影响迁移率的因素？电场电场样品：样品：大小（分子量）大小（分子量）形状（构型）形状（构型）电荷电荷共价闭环超螺旋共价闭环超螺旋DNA＞＞线性线性DNA＞开环的双链环状＞开环的双链环状DNA质粒质粒DNA三种构型：三种构型：共价闭环超螺旋共价闭环超螺旋线性线性开环的双链环状开环的双链环状胶浓度（％）胶浓度（％）线性线性DNA分子大小分子大小（（kb））0.35～～600.61～～200.70.8～～100.90.5～～71.20.4～～61.50.2～～42.00.1～～3本次电泳使用本次电泳使用1.0%琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶浓度与琼脂糖凝胶浓度与DNA分子的有效分离范围分子的有效分离范围•琼脂糖凝胶的制备琼脂糖凝胶的制备•上样：上样：加样前，样品先与加样前，样品先与6×上样缓冲液混匀上样缓冲液混匀•电泳电泳 ：：电压电压100v；；30min•结果观察：结果观察：凝胶成像仪凝胶成像仪　　   琼脂糖凝胶电泳操作琼脂糖凝胶电泳操作琼脂糖凝胶电泳上样琼脂糖凝胶电泳上样1：：DNA Marker（（ 5  l ））2：提取的质粒：提取的质粒DNA （（ 5  l ））3：质粒：质粒DNA酶切产物酶切产物 （（ 10  l ））+-1234每组上每组上2个样品个样品DNA Marker  (ladder) 　　Loading Buffer上样缓冲液上样缓冲液•EDTA•甘油甘油 ……………增大溶液密度增大溶液密度    •溴酚蓝溴酚蓝…………指示剂指示剂•二甲苯胺蓝二甲苯胺蓝……指示剂指示剂组成组成0.5TBE, 0.5-1.4%浓度的胶中，浓度的胶中，迁移率迁移率           溴酚蓝溴酚蓝=300bp                 二甲苯胺蓝二甲苯胺蓝=4kbp               Ø染色染色ü溴化乙锭溴化乙锭(Ethidium　　Bromide，，EB) :3,8-二氨基二氨基-5-乙基乙基-6苯基菲啶溴盐，能插入苯基菲啶溴盐，能插入DNA分子碱基对分子碱基对之间并与之结合之间并与之结合,在紫外光照射下呈现红橙荧光在紫外光照射下呈现红橙荧光,ü优点：优点：染色操作简便，快速染色操作简便，快速；；灵敏度高灵敏度高ü缺点：缺点：有致癌性有致癌性( (使用时一定要戴手套使用时一定要戴手套) )1 2M3 45 6 75000300020001000…bpM: DNA Marker DL50001. PCR 产物产物;             2. PCR 产物产物2.3.    质粒质粒DNA;             4. 质粒质粒 DNA3.5.    酶切产物酶切产物;              6. 酶切产物酶切产物结果分析结果分析。