生产菌种的培养和保藏.ppt

第六章第六章 生产菌种的培养和生产菌种的培养和保藏保藏第一节第一节 生产菌种的培养生产菌种的培养种子扩大培养种子扩大培养 是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处于是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，在经过扁瓶或摇瓶休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，在经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质量的纯种过程及种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质量的纯种过程目前工业规模的发酵罐容积已达几十、几百甚至上千立方米；目前工业规模的发酵罐容积已达几十、几百甚至上千立方米；如按如按5%5%接种量计，就需投入大量的种子；接种量计，就需投入大量的种子；逐级扩大一、种子的准则一、种子的准则1 1）菌种细胞的生长活力强，移种至发酵罐后能迅速生长，）菌种细胞的生长活力强，移种至发酵罐后能迅速生长，延滞期短延滞期短2 2）生理性状稳定）生理性状稳定3 3）菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求）菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求4 4）无杂菌污染）无杂菌污染5 5）保持稳定的生产能力）保持稳定的生产能力二、种子制备工艺二、种子制备工艺实验室种子制备阶段：实验室种子制备阶段： 琼脂斜面琼脂斜面 固体培养基扩大培养固体培养基扩大培养 摇瓶液体培养摇瓶液体培养生产种子制备阶段：生产种子制备阶段： 种子罐扩大培养种子罐扩大培养对接种物的一般要求：对接种物的一般要求：1 1）应以高产菌株中分离获得的纯系作为出发菌株。

菌株纯度）应以高产菌株中分离获得的纯系作为出发菌株菌株纯度高，性状稳定，不易发生变异高，性状稳定，不易发生变异2 2）生理活性强生理活性强 若以菌体细胞为接种物，应采取正在旺盛生长的繁殖期细若以菌体细胞为接种物，应采取正在旺盛生长的繁殖期细胞，菌体细胞应均匀，同步率高以孢子为接种物，应采用易胞，菌体细胞应均匀，同步率高以孢子为接种物，应采用易于萌发的孢子于萌发的孢子一一) ) 实验室种子制备实验室种子制备 对于产孢子能力强的及孢子发芽、生长繁殖快的菌种可以对于产孢子能力强的及孢子发芽、生长繁殖快的菌种可以采用固体培养基培养孢子，孢子可直接作为种子罐的种子；采用固体培养基培养孢子，孢子可直接作为种子罐的种子；这样操作简便，不易污染杂菌这样操作简便，不易污染杂菌 如：柠檬酸生产的制种，用麸皮培养基产生大量孢子直如：柠檬酸生产的制种，用麸皮培养基产生大量孢子直接用于种子罐接种接用于种子罐接种 对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，可以用摇瓶液对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，可以用摇瓶液体培养法孢子接入含液体培养基的摇瓶中，恒温振荡培养，体培养法。

孢子接入含液体培养基的摇瓶中，恒温振荡培养，获得菌丝体，作为种子获得菌丝体，作为种子 如：用灰色链霉菌生产链霉素如：用灰色链霉菌生产链霉素 用卡那链霉菌生产卡那霉素用卡那链霉菌生产卡那霉素 对于不产孢子的细菌，生产上一般采用将试管斜面菌对于不产孢子的细菌，生产上一般采用将试管斜面菌种接入茄瓶斜面或摇瓶培养种接入茄瓶斜面或摇瓶培养 如：谷氨酸棒杆菌生产谷氨酸如：谷氨酸棒杆菌生产谷氨酸1 1、孢子的制备、孢子的制备1 1）细菌孢子的制备）细菌孢子的制备ü细菌的斜面培养基多采用碳源限量而氮源丰富的细菌的斜面培养基多采用碳源限量而氮源丰富的配方ü培养温度一般为培养温度一般为3737˚C Cü细菌菌体培养时间一般为细菌菌体培养时间一般为1-21-2天，产芽孢的细菌天，产芽孢的细菌培养则需要培养则需要5-105-10天2 2）霉菌孢子的制备）霉菌孢子的制备ü霉菌孢子的培养一般以大米、小米、玉米、麸皮、麦霉菌孢子的培养一般以大米、小米、玉米、麸皮、麦粒等天然农产品为培养基粒等天然农产品为培养基ü培养的温度一般为培养的温度一般为25-2825-28˚C Cü培养时间一般为培养时间一般为4-144-14天。

天3 3）放线菌孢子的制备）放线菌孢子的制备ü放线菌的孢子培养一般采用琼脂斜面培养基，培养基放线菌的孢子培养一般采用琼脂斜面培养基，培养基中含有一些适合产孢子的营养成分，如麸皮、豌豆浸中含有一些适合产孢子的营养成分，如麸皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些无机盐等汁、蛋白胨和一些无机盐等ü培养温度一般为培养温度一般为2828˚C Cü培养时间为培养时间为5-145-14天二）生产种子制备二）生产种子制备种子罐级数的确定种子罐级数的确定种子罐级数种子罐级数是指制备种子需逐级扩大培养的次数是指制备种子需逐级扩大培养的次数一般根据菌种生长特性、菌体繁殖速度以及所采用发一般根据菌种生长特性、菌体繁殖速度以及所采用发酵罐的容积而定酵罐的容积而定 对于生长快的细菌，种子用量比例小，故种子罐相应也少对于生长快的细菌，种子用量比例小，故种子罐相应也少如：谷氨酸生产中，采用茄瓶斜面或摇瓶种子接入种子罐于如：谷氨酸生产中，采用茄瓶斜面或摇瓶种子接入种子罐于32℃32℃培养培养7 7～～10h10h，，菌体浓度达菌体浓度达10108 8～～10109 9个个/ml/ml，，即可接入发酵罐即可接入发酵罐作为种子。

作为种子 这称为这称为一级种子罐扩大培养一级种子罐扩大培养，也称，也称二级发酵二级发酵 生长较慢的菌种，如青霉素生产菌种，其孢子悬浮液接入一生长较慢的菌种，如青霉素生产菌种，其孢子悬浮液接入一级种子罐扩大培养于级种子罐扩大培养于27℃27℃培养培养40h40h，，此时孢子发芽，长出短菌丝，此时孢子发芽，长出短菌丝，再移至含有新鲜培养基的第二级种子罐，于再移至含有新鲜培养基的第二级种子罐，于27℃27℃培养培养1010～～24h24h，，菌丝迅速繁殖，获粗壮菌体，即可移至发酵罐作为种子菌丝迅速繁殖，获粗壮菌体，即可移至发酵罐作为种子这称为这称为二级种子罐扩大培养二级种子罐扩大培养，也称，也称三级发酵三级发酵一般一般50m50m3 3发酵罐都采用三级发酵发酵罐都采用三级发酵 生长更慢的菌种，链霉素生产菌种灰色链霉菌，一般采用生长更慢的菌种，链霉素生产菌种灰色链霉菌，一般采用三级种子罐扩大培养（四级发酵）三级种子罐扩大培养（四级发酵） 在小型罐（在小型罐（5 5～～500L500L））中进行实验时，通常采用直接将孢子中进行实验时，通常采用直接将孢子或菌丝体接入罐中发酵，这可称为或菌丝体接入罐中发酵，这可称为一级发酵一级发酵。

 种子罐的级数越少，越有利于简化工艺和控制，并可减少种子罐的级数越少，越有利于简化工艺和控制，并可减少由于多次移种而带来的染菌的机会由于多次移种而带来的染菌的机会 但也必须考虑尽量延长发酵罐生产产物的时间，缩短由于种但也必须考虑尽量延长发酵罐生产产物的时间，缩短由于种子发芽、生长而占用的非生产时间，以提高发酵罐的生产率子发芽、生长而占用的非生产时间，以提高发酵罐的生产率 虽然种子罐级数随产物的品种及生产规模而定，但也与所选虽然种子罐级数随产物的品种及生产规模而定，但也与所选用工艺条件有关用工艺条件有关 如改变种子罐的培养条件，加速了孢子发芽及菌体的繁殖，如改变种子罐的培养条件，加速了孢子发芽及菌体的繁殖，也可相应地减少种子罐的级数也可相应地减少种子罐的级数第二节第二节 种子质量的控制种子质量的控制一、影响孢子质量的因素及控制一、影响孢子质量的因素及控制•培养基培养基•培养条件培养条件•培养时间和冷藏时间培养时间和冷藏时间1 1）原材料质量）原材料质量 生产过程中经常出现种子质量不稳定的现象，其主要生产过程中经常出现种子质量不稳定的现象，其主要原因是原材料质量波动。

原因是原材料质量波动如：如： 四环素、土霉素生产中，配制产孢斜面培养基用四环素、土霉素生产中，配制产孢斜面培养基用的麸皮，因小麦产地、品种、加工方法及用量的不同对的麸皮，因小麦产地、品种、加工方法及用量的不同对孢子质量均有一定影响孢子质量均有一定影响 制备霉菌用的大米，其产地、颗粒大小、均匀程度制备霉菌用的大米，其产地、颗粒大小、均匀程度不同，孢子质量也不同不同，孢子质量也不同 蛋白胨加工原料不同（如鱼胨或骨胨）对孢子影响蛋白胨加工原料不同（如鱼胨或骨胨）对孢子影响也不同 原材料质量的波动，起主要作用的是其中的无机离子原材料质量的波动，起主要作用的是其中的无机离子含量不同含量不同1 1、培养基、培养基2 2）水质的影响）水质的影响 地区不同、季节变化和水源污染，均可造成地区不同、季节变化和水源污染，均可造成水质波动，影响种子质量水质波动，影响种子质量 菌种在固体培养基上可呈现多种不同代谢类型菌种在固体培养基上可呈现多种不同代谢类型的菌落，氮源品种越多，出现的菌落类型也越多，的菌落，氮源品种越多，出现的菌落类型也越多，不利于生产的稳定。

不利于生产的稳定2 2、培养条件、培养条件1 1）温度）温度温度对多数品种斜面孢子质量有显著影响温度对多数品种斜面孢子质量有显著影响 如如: :土霉素生产种子，在高于土霉素生产种子，在高于37℃37℃培养时，培养时，孢子接入发酵罐后表现出糖代谢变慢，氨基孢子接入发酵罐后表现出糖代谢变慢，氨基氮回升提前，菌丝过早自溶，效价降低等氮回升提前，菌丝过早自溶，效价降低等2 2）湿度）湿度制备斜面孢子培养基的湿度对孢子的数量制备斜面孢子培养基的湿度对孢子的数量和质量有较大影响和质量有较大影响 不同湿度对龟裂链霉菌（产土霉素）斜面生长的影响不同湿度对龟裂链霉菌（产土霉素）斜面生长的影响相对湿度相对湿度 斜面外观斜面外观 活孢子数（活孢子数（××10108 8/ /支）支）16.516.5～～19 19 上部稀薄，下部稠，略黄上部稀薄，下部稠，略黄 1.21.22525～～36 36 上部薄，中部均匀，发白上部薄，中部均匀，发白 2.32.34040～～45 45 一片白，孢子丰富，稍皱一片白，孢子丰富，稍皱 5.75.73 3）通气量）通气量一般需保证充足的通气一般需保证充足的通气3 3、培养时间和冷藏时间、培养时间和冷藏时间（（1 1）培养时间）培养时间一般来说，衰老的孢子不如年轻的孢子，因为衰老的一般来说，衰老的孢子不如年轻的孢子，因为衰老的孢子已在逐步进入发芽阶段，核物质趋于分化状态。

孢子已在逐步进入发芽阶段，核物质趋于分化状态过于衰老的孢子会导致生产能力的下降过于衰老的孢子会导致生产能力的下降措施：孢子培养的时间应该控制在孢子量多、孢子成措施：孢子培养的时间应该控制在孢子量多、孢子成熟、发酵产量正常的阶段终止培养熟、发酵产量正常的阶段终止培养2 2）冷藏时间）冷藏时间 冷藏对孢子质量的影响与孢子成熟程度有关如土霉素生产冷藏对孢子质量的影响与孢子成熟程度有关如土霉素生产菌种孢子斜面培养菌种孢子斜面培养4 4天左右即于天左右即于4 4˚C C冰箱保存，发现冷藏冰箱保存，发现冷藏7-87-8天天菌体细胞开始自溶而培养菌体细胞开始自溶而培养5 5天以后冷藏，天以后冷藏，2020天未发现自溶天未发现自溶 冷藏时间对孢子的生产能力也有影响例如在链霉素生产中，冷藏时间对孢子的生产能力也有影响例如在链霉素生产中，斜面孢子在斜面孢子在6 6˚ C C冷藏两个月后的发酵单位比冷藏一个月降低冷藏两个月后的发酵单位比冷藏一个月降低18%18%，冷藏，冷藏3 3个月后降低个月后降低35%35%4 4、接种量、接种量 接种量大小影响到培养基中孢子的数量，进接种量大小影响到培养基中孢子的数量，进而影响菌体的生理状况。

而影响菌体的生理状况二、影响种子质量的因素及控制二、影响种子质量的因素及控制•孢子的质量孢子的质量•培养基培养基•培养条件培养条件•种龄种龄•接种量接种量•营养成分适合种子培养的需要营养成分适合种子培养的需要–选择有利于孢子发芽和菌体生长的培养基；选择有利于孢子发芽和菌体生长的培养基；–营养上要易于被菌体直接吸收和利用；营养上要易于被菌体直接吸收和利用；–营养成分要适当丰富和完全，氮源和维生素含量要高营养成分要适当丰富和完全，氮源和维生素含量要高•营养成分要尽可能与发酵培养基相近营养成分要尽可能与发酵培养基相近1 1、培养基、培养基（（1 1）温度）温度（（2 2）通气量）通气量 有足够的通气量可以提高种子质量有足够的通气量可以提高种子质量 例如，青霉素的生产菌种在制备过程中将通气充足和例如，青霉素的生产菌种在制备过程中将通气充足和不足两种情况下得到的种子分别接入发酵罐内，它们不足两种情况下得到的种子分别接入发酵罐内，它们的发酵单位可相差的发酵单位可相差1 1倍但也有例外，例如土霉素生倍但也有例外，例如土霉素生产菌，一级种子罐的通气量小对发酵有利产菌，一级种子罐的通气量小对发酵有利。

2 2、培养条件、培养条件3 3、种龄、种龄种龄种龄————种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐或发种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间酵罐时的培养时间选择适当种龄的菌种接种十分重要选择适当种龄的菌种接种十分重要 通常，种龄以菌体处于生命力极为旺盛的对数期，且培通常，种龄以菌体处于生命力极为旺盛的对数期，且培养液中菌体量还未达到最高峰时，较为合适养液中菌体量还未达到最高峰时，较为合适 过于年轻的种子接入发酵罐后，往往会出现前期生长缓慢、过于年轻的种子接入发酵罐后，往往会出现前期生长缓慢、发酵周期延长、产物开始形成的时间推迟，造成异常发酵的情发酵周期延长、产物开始形成的时间推迟，造成异常发酵的情况 过老的种子会引起生产能力下降，菌体过早自溶过老的种子会引起生产能力下降，菌体过早自溶 不同品种或同不同品种或同一品种的工艺条一品种的工艺条件不同，其菌龄件不同，其菌龄也不一样，一般也不一样，一般要经过多次试验，要经过多次试验，考察其发酵罐中考察其发酵罐中产量的多少来确产量的多少来确定最适种龄定最适种龄嗜碱性芽孢杆菌种嗜碱性芽孢杆菌种龄对产龄对产酶酶（碱性蛋白酶）的影响（碱性蛋白酶）的影响4 4、接种量、接种量接种量接种量————是指移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例。

是指移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例大多数抗生素发酵的最适接种量为大多数抗生素发酵的最适接种量为7 7～～15%15%，有时可增加到，有时可增加到2020～～25%25%而由棒状杆菌生产谷氨酸而由棒状杆菌生产谷氨酸 接种量只需接种量只需1%1% 除了始于斜面培养的初次接种外，发酵过程的整个阶段接除了始于斜面培养的初次接种外，发酵过程的整个阶段接种量一般均需种量一般均需0.50.5～～10%10%的接种量的接种量 接种量的大小取决于生产菌种在发酵中生长繁殖的速度接种量的大小取决于生产菌种在发酵中生长繁殖的速度 采用较大的接种量可以缩短发酵罐中菌体繁殖到达高峰采用较大的接种量可以缩短发酵罐中菌体繁殖到达高峰的时间，使产物的形成提前到来的时间，使产物的形成提前到来 近年来，不少厂家以加大种子量及采用丰富培养基作为获得近年来，不少厂家以加大种子量及采用丰富培养基作为获得高产的措施；有的产品采用两个种子罐接一个发酵罐的双种法高产的措施；有的产品采用两个种子罐接一个发酵罐的双种法 如卡那霉素生产中采用双种比单种的发酵单位提高如卡那霉素生产中采用双种比单种的发酵单位提高8%8%，，且达到产量高峰的时间提前。

且达到产量高峰的时间提前 但如果接种量过大，往往使菌体生长过快、培养液黏度增如果接种量过大，往往使菌体生长过快、培养液黏度增加，造成溶氧不足，从而影响产物的合成加，造成溶氧不足，从而影响产物的合成 如由嗜碱芽孢杆菌生产碱性蛋白酶的发酵，如由嗜碱芽孢杆菌生产碱性蛋白酶的发酵，1%1%接种量产接种量产酶活最高，在酶活最高，在0.50.5～～4%4%之间虽有差别，但影响不大；如超过之间虽有差别，但影响不大；如超过4%4%则酶产量明显下降则酶产量明显下降三、种子质量的控制措施三、种子质量的控制措施1 1、菌种稳定性的检查、菌种稳定性的检查 单单菌菌分离，摇瓶测定生产能力以不低于其原有的分离，摇瓶测定生产能力以不低于其原有的生产活力为原则生产活力为原则2 2、无（杂）菌检查、无（杂）菌检查镜镜检检肉汤或琼脂斜面培养进行检查肉汤或琼脂斜面培养进行检查生化分析生化分析 如测定营养消耗的速度、如测定营养消耗的速度、pHpH变化、溶氧变化、溶氧 利用情况等利用情况等3 3、接种技术、接种技术压差压差法法 接种瓶接种瓶 压力差压力差火焰封口法火焰封口法 在种子罐接种口周围设有沟槽，沟槽在种子罐接种口周围设有沟槽，沟槽内注入少量酒精，点燃酒精使接种口被围在内注入少量酒精，点燃酒精使接种口被围在一圈火焰之中；在火焰圈中即可将菌悬液倒一圈火焰之中；在火焰圈中即可将菌悬液倒入种子罐中。

入种子罐中 从种子罐到发酵罐的接种，是通过接种管道，在压力从种子罐到发酵罐的接种，是通过接种管道，在压力作用下进行的作用下进行的四、种子质量的标准四、种子质量的标准 为了保证各级种子移种前的质量，除了保证规定的为了保证各级种子移种前的质量，除了保证规定的培养条件外，在过程中还要定期取样测定一些参数以观培养条件外，在过程中还要定期取样测定一些参数以观察基质的代谢变化及菌体形态是否正常察基质的代谢变化及菌体形态是否正常通常测定的参数有：通常测定的参数有：1 1、生化指标、生化指标1 1））pH pH 2 2）培养基灭菌后磷、糖、氨基氮的含量）培养基灭菌后磷、糖、氨基氮的含量2 2、细胞或菌体、细胞或菌体ü菌体形态、菌体浓度和培养液外观（色素、颗粒等）菌体形态、菌体浓度和培养液外观（色素、颗粒等）ü单细胞：菌体健壮、菌形一致、均匀整齐，有的还要单细胞：菌体健壮、菌形一致、均匀整齐，有的还要求有一定的排列或形态；求有一定的排列或形态；ü霉菌、放线菌：菌丝粗壮、对某些染料着色力强、生霉菌、放线菌：菌丝粗壮、对某些染料着色力强、生长旺盛、菌丝分枝情况和内含物情况好。

长旺盛、菌丝分枝情况和内含物情况好3 3、产物生成量、产物生成量 在抗生素发酵中，产物生成量是考察种子质量的在抗生素发酵中，产物生成量是考察种子质量的重要指标，因为种子液中产物生成量的多少间接反映重要指标，因为种子液中产物生成量的多少间接反映种子的生产能力和成熟程度种子的生产能力和成熟程度4 4、酶活力、酶活力种子液中某种酶的活力，与目的产物的产量有一定的关联种子液中某种酶的活力，与目的产物的产量有一定的关联五、种子异常的分析五、种子异常的分析菌种生长发育缓慢或过快菌种生长发育缓慢或过快菌丝结团菌丝结团菌丝粘壁菌丝粘壁第三节第三节 菌种保藏与复壮菌种保藏与复壮一、菌种保藏原理一、菌种保藏原理 主要是根据菌种的生理生化特点，人工创造条件，使孢主要是根据菌种的生理生化特点，人工创造条件，使孢子或菌体的生长代谢活动尽量降低，以减少其变异子或菌体的生长代谢活动尽量降低，以减少其变异 一般可通过保持培养基营养成分在最低水平、缺氧状一般可通过保持培养基营养成分在最低水平、缺氧状态、干燥和低温，使菌种处于态、干燥和低温，使菌种处于““休眠休眠””状态，抑制其繁殖状态，抑制其繁殖能力。

能力二、保藏方法二、保藏方法1 1、斜面冰箱保藏法、斜面冰箱保藏法 4 4  C C ；； 3-63-6个月个月2 2、、沙土管保藏法沙土管保藏法 产孢子或芽孢微生物，产孢子或芽孢微生物，1 1年年3 3、、菌丝速冻法菌丝速冻法 甘油或二甲基亚砜作为保护剂，甘油或二甲基亚砜作为保护剂，-20 -20  C C 4 4、、石蜡油封存法石蜡油封存法 1 1年左右年左右5 5、真空冷冻干燥保藏法、真空冷冻干燥保藏法 任何微生物；一般任何微生物；一般5 5年以上年以上6 6、、液氮超低温保藏法液氮超低温保藏法 -196 -196  C C ；；保护剂；保存期长保护剂；保存期长三、国内外重要菌种保藏机构三、国内外重要菌种保藏机构1、、ATCC (American Type Culture Collection) 美国标准菌种收藏所，美国标准菌种收藏所， 马里兰州，罗克维尔市马里兰州，罗克维尔市2、、CSH (Cold Spring Harbor Laboratory) 冷泉港研究室，冷泉港研究室， 美国美国3、、IAM (Institute of Applied Microbiology,University of Tokyo) 日本东京大学应用微生物研究所，日本东京大学应用微生物研究所， 日本东京日本东京4、、IFO (Institute for Fermentation, Osaka) 发酵研究所，日本大阪发酵研究所，日本大阪5 5、、普通微生物菌种保藏管理中心普通微生物菌种保藏管理中心 （（CCGMC CCGMC ）） 中科院微生物所，北京中科院微生物所，北京6 6、、工业微生物菌种保藏管理中心工业微生物菌种保藏管理中心 (CICC)(CICC) 轻工部食品发酵工业科学研究所，北京轻工部食品发酵工业科学研究所，北京不同菌种保藏方法比较不同菌种保藏方法比较保藏方法保藏方法适用范围适用范围保存有效时间保存有效时间斜面适温斜面适温各类微生物各类微生物( (除病毒外除病毒外) )细菌、酵母细菌、酵母1 1个月；霉菌、个月；霉菌、放线菌放线菌2-32-3个月个月斜面冰箱斜面冰箱（（4 4度）度）各类微生物各类微生物( (除病毒外除病毒外) )细菌、酵母细菌、酵母3 3个月；霉菌、个月；霉菌、放线菌放线菌6 6个月个月矿矿 油油酵母、霉菌、放线菌酵母、霉菌、放线菌低温低温1 1年以上年以上砂土管砂土管芽孢杆菌、产孢子霉菌、芽孢杆菌、产孢子霉菌、放线菌放线菌低温低温1-1-数年数年冷冻干燥冷冻干燥各类微生物各类微生物低温低温1-201-20年年固体曲固体曲产大量孢子的霉菌产大量孢子的霉菌低温低温1-1-数年数年四、菌种的复壮（四、菌种的复壮（rejuvenationrejuvenation））•狭义的复壮是指在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种狭义的复壮是指在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和生产性能测定等方法，从衰退的群体中找出未衰分离和生产性能测定等方法，从衰退的群体中找出未衰退的个体，以达到恢复该菌原有典型性状的措施。

退的个体，以达到恢复该菌原有典型性状的措施•广义的复壮是指在菌种的生产性能未衰退前就有意识的广义的复壮是指在菌种的生产性能未衰退前就有意识的经常进行纯种的分离和生产性能测定工作，以期菌种的经常进行纯种的分离和生产性能测定工作，以期菌种的生产性能逐步提高生产性能逐步提高措施：措施：•纯种分离纯种分离•淘汰衰退的个体淘汰衰退的个体•选择合适的培养条件选择合适的培养条件　　　　•1 1、种子制备的过程（次重点）、种子制备的过程（次重点）•理解：孢子、种子制备工艺理解：孢子、种子制备工艺•2 2、种子质量的控制（重点）、种子质量的控制（重点）•识记：影响孢子、种子质量的因素识记：影响孢子、种子质量的因素•理解：种子质量的控制；种子异常的原因理解：种子质量的控制；种子异常的原因小小 结结•3 3、菌种保藏与复壮（次重点）、菌种保藏与复壮（次重点）•理解：菌种保藏原理；主要保藏方法理解：菌种保藏原理；主要保藏方法•应用：对不同菌种选择适宜的保藏方法及复壮方法应用：对不同菌种选择适宜的保藏方法及复壮方法思考题思考题1 1、什么是种子的扩大培养？、什么是种子的扩大培养？2 2、在大规模发酵的种子制备过程中，实验室阶段和生产、在大规模发酵的种子制备过程中，实验室阶段和生产车间阶段在培养基和培养物选择上各有何特点？车间阶段在培养基和培养物选择上各有何特点？3 3、什么是发酵级数？发酵级数对发酵有何影响，影响发、什么是发酵级数？发酵级数对发酵有何影响，影响发酵级数的因素有哪些？酵级数的因素有哪些？ 4 4、简述菌种保藏的基本原理和菌种保藏方法。

简述菌种保藏的基本原理和菌种保藏方法。