酶工程 第七章 酶分子定向进化.ppt

酶工程Enzyme Engineering林范学fanxuelin@1 1/50/501 1第七章￿酶分子定向进行u酶分子定向进化（enzyme￿molecular￿directed￿evolution）是模拟自然进化过程（随机变异和自然选择），在体外进行酶基因的人工随机突变，建立突变基因文库，在人工控制条件的特殊环境下，定向选择得到具有优良催化特性的酶的突变体的技术过程u简称酶定向进化（enzyme￿directed￿evolution）2 2u分子定向进化￿ 以各种生物大分子为进化对象，目的是改良目标分子的结构、功能和特性，主要包括：l酶分子定向进化l蛋白质定向进化l核酸分子定向进化1993年年,美国科学家美国科学家Arnold F H首先提出酶分子的首先提出酶分子的定向进化定向进化的概念，并的概念，并用于天然酶的改造或构建新的非天然酶用于天然酶的改造或构建新的非天然酶3 3u定向进化示意图随机突变+定向选择＝目标突变体细菌细菌诱发突变诱发突变的因素的因素5050 0 0C C培养培养突变体库突变体库选择压力选择压力（温度）（温度）温度耐受型突温度耐受型突变体变体最适生长温度最适生长温度为为37370 0C C最适生长温度提高了！最适生长温度提高了！4 4u天然酶的局限l酶催化的精确性和有效性常常不能很好地满足酶学研究和工业化应用的要求稳定性差活性低使催化效率很低缺乏有商业价值的催化功能u天然酶的局限性源于酶的自然进化过程。

5 5u现代生物工程对酶的要求l￿能具备长期稳定性和活性l￿能适用于水及非水相环境l￿能接受不同的底物甚至是自然界不存在的合成底物l￿能够在特殊环境中合成和拆分制作新药物或药物的原材料6 6u酶定向进化的基本过程l基因的随机突变l定向选择酶基因酶基因随机突变随机突变构建突变基因文库构建突变基因文库筛选筛选负突变基因负突变基因正突变基因正突变基因进化酶进化酶反复进行反复进行易错易错PCRDNA 重排重排基因家族重排基因家族重排平板筛选法平板筛选法荧光筛选法荧光筛选法噬菌体表面展示法噬菌体表面展示法细胞表面展示法细胞表面展示法核糖体表面展示法核糖体表面展示法高通量筛选高通量筛选7 7u第一节￿酶基因体外随机突变u第二节￿酶突变基因的定向选择u第三节￿酶分子定向进化的应用8 8第一节￿酶基因体外随机突变基因体外随机突变方法的特点随机突变方法特点易错PCR技术error-prone￿PCR从酶的单一基因出发，在特定的反应条件下进行PCR扩增，使碱基配对出现错误而引起基因突变基因重排技术DNA￿shuffling从两条以上的正突变基因出发，经过酶切和不加引物的PCR扩增，使碱基序列重新排布而引起基因突变基因家族重排技术DNA￿family￿shuffling从基因家族的若干基因出发，经过酶切和不加引物的PCR扩增，使碱基序列重新排布而引起基因突变9 9一、易错PCR技术u易错PCR技术(error-prone￿PCR)是从酶的单一基因出发，在改变反应条件下进行聚合酶链反应，使扩增得到的基因出现碱基配对错误，从而引起基因突变的技术过程。

1)易错PCR反应过程l①￿双链DNA变性：85-95℃l②￿引物与单链DNA退火结合：50-70℃l③￿引物延伸：70-75℃1010(2)易错PCR反应条件l①￿Mg2+浓度较高，以稳定非互补的碱基对普通PCR￿Mg2+浓度0.5-2.5mmol/L，易错PCR提高Mg2+浓度l②￿添加Mn2+￿，以降低聚合酶对模版的特异性l③￿4种底物的浓度比改变，即采用浓度不平衡的各种底物，使碱基配对错误出现频率增加易错易错PCR具体反应条件要根据进化目的、具体反应条件要根据进化目的、DNA聚聚合酶种类和模版情况等合酶种类和模版情况等多次试验而确定多次试验而确定11111212u易错PCR示意图1313u￿易错PCR,￿遗传变化只发生在单一分子内部,￿所以属于无性进化（asexual￿evolution）u采用易错PCR时，要控制好适当的突变频率l突变频率突变频率太低太低，，难于筛选难于筛选到理想的正突变体到理想的正突变体l突变频率突变频率太高太高，，增加筛选工作量增加筛选工作量（大多突变为负突变和中性（大多突变为负突变和中性突变）突变）l一般情况下一般情况下, , 一个目的基因一个目的基因通过易错通过易错PCRPCR引起的引起的错配碱基数错配碱基数目控制在目控制在2-52-5个个。

u通常采用连续易错PCR￿(￿Sequential￿error￿prone￿PCR)￿：l将一次将一次PCR PCR 扩增得到的扩增得到的有益突变基因有益突变基因作为下一次作为下一次PCR PCR 扩增的扩增的模板模板, , 连续反复进行随机诱变连续反复进行随机诱变1414uChen.KChen.K和ArnoldArnold在 19931993年采用易错PCRPCR对该枯草杆菌蛋白酶进行了体外进化研究他们通过降低反应体系中dATPdATP的浓度, ,对编码该酶从第4949位氨基酸到C C端的DNADNA片段进行易错PCRPCR, ,经筛选得到的几个突变株在高浓度的二甲基甲酰胺(DMF)(DMF)中酶活性明显提高, ,其中突变体PC3PC3在60%60%的DMFDMF中, ,酶活力是野生型的256256倍将PC3PC3再进行两个循环的定向进化, ,得到的突变体酶活力比PC3PC3还要高3 3倍1515u易错PCR特点：l操作简便，随机突变丰富l正突变概率低，突变基因文库较大，筛选工作量大l适合较小基因（＜800bp）的定向进化1616二、DNA重排技术uDNA重排（DNA￿shuffling）技术又称DNA改组技术，是从两种以上的同源正突变基因出发，用酶切成随机片段，经过不加引物的多次PCR循环，使DNA的碱基序列重新排布而引起基因突变的技术过程。

u￿此方法又称为有性PCR(Sexual￿PCR),通过将亲本基因群中的突变尽可能组合在一起, ,以导致更大的变异, ,最终获得具有最佳突变组合u1994年由Stemmer等人首次提出，使用该技术使β-内酰胺酶定向进化，催化效率提高32000倍1717uDNA￿shuffling1818DNA重组装原理图重组装原理图(DNA shuffling)1. DNaseI产生随机片段；产生随机片段；2. 随机片段变性；随机片段变性；3. 随机片段复性；随机片段复性；4. 延伸延伸 反复重复反复重复2-4步后，可获得全长步后，可获得全长DNA片段片段 1919u其基本操作过程￿:￿（1）靶基因经随机突变产生含不同突变类型的亲本基因群,￿用DNase￿I￿随机切割;￿（2）得到的片段经过不加引物的多次PCR￿循环,￿在该过程中,￿这些片段之间互为引物和模板进行扩增,￿直至获得全长基因;￿（3）再加入基因的两端引物进行常规PCR,￿最终获得发生改组的基因库2020uDNA￿重排技术特点l正突变体概率高，进化速度较快l在获得全长基因之前要除去DNase￿IuDNA重排技术的改进l交错延伸PCR技术l随机引物体外重组技术21211、交错延伸PCR技术u交错延伸PCR￿(Stagger￿extension￿process￿PCR，StEP)是在PCR￿反应中,￿将含不同点突变的模板（两个或多个DNA片段）混合,￿将常规的退火和延伸合并为一步,￿并大大缩短其反应时间（55℃，5s）,￿从而只能合成出非常短的新生链,￿经变性的新生链再作为引物随机地杂交到含不同突变的模板上继续延伸,￿此过程反复进行直至获得全长基因。

结果会产生间隔的含不同模板序列的新生DNA￿分子2222uStEP过程1个引物个引物2个模板个模板退火结合退火结合延伸产生短片段延伸产生短片段短片段为引物与短片段为引物与模板退火结合模板退火结合继续延伸片段至继续延伸片段至全长的基因长度全长的基因长度分离全长基因，分离全长基因，加入外源引物扩加入外源引物扩增全长基因增全长基因24242、随机引物体外重组技术u随机引物体外重组技术（random-priming￿in￿vitro￿recombination，RPR）采用单链DNA为模板，配合若干条随机序列引物进行PCR反应，产生大量互补于模板不同位点的DNA小片段，然后除去模板，这些DNA小片段互为模板和引物进行扩增，通过碱基序列的重新排布而获得全长突变基因26262727u与常规DNA￿改组相比,RPR￿技术有如下优点:(￿1)￿可利用单链DNA￿为模板,￿故可直接用mRNA￿或cDNA￿为亲本进行进化￿2)￿在该方法中,￿随机片段不是由亲本基因切割获得,￿故大大降低了亲本DNA￿的制备量￿3)￿省去DNaseI￿切割过程,￿更为简单￿4)￿合成的随机引物具有同样长度,￿无序列倾向性。

在理论上,￿PCR￿扩增时模板上每个碱基都应被复制或以相似的频率发生突变￿5)￿随机引发合成的DNA￿片段大小,不受DNA￿模板长度的限制2828三、基因家族重排技术u基因家族重排技术（gene￿family￿shuffling）又称基因家族改组技术，是从基因家族的若干同源基因出发，用酶（DNase￿I）切割成随机片段，经过不加引物的多次PCR扩增，使DNA碱基序列重新排布而引起基因突变的技术过程2929uDNA shuffling与与Family shuffling：：Ø基本过程大致相同基本过程大致相同Ø出发基因不同出发基因不同3030当以单一的酶分子当以单一的酶分子基因进行定向进化基因进行定向进化时时, , 基因的多样化基因的多样化起源于起源于易错易错PCRPCR 等等反应中产生的反应中产生的随机随机突变突变, , 所以采用这所以采用这种过程累积有益突种过程累积有益突变的变的速度比较慢速度比较慢 从自然界中存在的从自然界中存在的基因家族基因家族出出发发, , 利用它们之间的同源序列利用它们之间的同源序列进行进行DNA DNA 改组由于每一个天改组由于每一个天然酶的基因都经过千百万年的然酶的基因都经过千百万年的进化进化, , 并且基因之间存在并且基因之间存在比较比较显著的差异显著的差异, , 所以获得的重组所以获得的重组基因库充分体现了基因库充分体现了基因的多样基因的多样化化，排除了不必要的突变，大，排除了不必要的突变，大大加速了基因的体外进化速度。

大加速了基因的体外进化速度DNA shufflingFamily shuffling3131单链化单链化限制性内限制性内切酶消化切酶消化Dnase I 消化消化无外源引物无外源引物PCR重组基因库重组基因库片段化片段化同源基因同源基因常规常规PCR3种基因家族改组方法原理图种基因家族改组方法原理图1.常规基因家族改组常规基因家族改组2.单链单链DNA介导的基因家族改组介导的基因家族改组3.限制性内切酶介导的基因家族改组限制性内切酶介导的基因家族改组3种基因家族改组方法获得的突变种基因家族改组方法获得的突变基因多样性比较基因多样性比较 Kikuchi采用后采用后2种改组方法，从种改组方法，从儿儿茶酚茶酚2,3-双加氧酶双加氧酶的的2个同源基因出个同源基因出发发, 对其进行体外定向进化的研究对其进行体外定向进化的研究最终筛选到的进化酶在最终筛选到的进化酶在50℃℃的的半衰半衰期期分别比两种天然酶延长分别比两种天然酶延长12和和26倍1007550250123产生的杂合基因百分比产生的杂合基因百分比3232第二节￿酶基因突变的定向选择u酶基因突变的定向选择是在人工控制条件的特殊环境下，按照人们所设定的进化方向对突变基因进行选择，以获得具有优良催化特性的酶的突变体的技术过程。

突变基因突变基因基因载体基因载体重组重组DNA突变基因文库突变基因文库目的基因目的基因进化酶进化酶基因重组基因重组组装组装筛选筛选表达表达3333一、突变基因文库的构建u突变基因文库的构建是将各种不同的突变基因与载体重组，再转入适宜的细胞或包装成重组λ噬菌体的技术过程u构建突变基因文库是选择获得所需突变基因的重要步骤，必须注意基因文库的包容性和完整性，以构建丰富多样的高质量的突变基因文库u构建突变基因文库的过程主要包括载体的选择、基因重组、形成基因文库等3434（一）构建基因文库的质量要求u构建的突变基因文库必须尽可能地把各种突变基因包含在其中，并且能够完整地反映基因的结构和功能信息所以突变基因文库不但必须具有包容性，还必须具有突变基因序列的完整性35351.￿文库的包容性u突变基因文库的包容性是指所构建的文库必须尽可能地包含基因的任何一种可能的突变信息，包括正突变、负突变、和中性突变，以便进行全面的筛选u要求构建的文库必须有足够大的容量，通常一个包容性好的文库应具有106甚至更大的库容量￿36362.￿文库的完整性u突变基因文库的完整性是指文库中包含的DNA片段必须尽可能完整地反映基因的结构和功能信息，以便通过筛选得到的突变基因能够通过表达获得完整的具有催化功能的进化酶。

￿3737（二）构建突变基因文库的主要过程u构建突变基因文库的过程主要包括：l载体的选择l基因重组l形成基因文库等38381.￿载体的选择u突变基因文库的构建，要通过DNA连接酶的作用，将突变基因与适当的载体（vector）重组，所以首先要根据目的基因的特性、载体的特点和重组DNA的筛选方法等选择适宜的载体l质粒载体l噬菌体DNA载体l黏粒载体l噬菌粒载体3939（1）质粒载体u质粒（plasmid）是存在于微生物细胞内染色体外的遗传单位，是一种闭合环状双链DNA分子u质粒载体是由天然质粒经过人工改造而成的一种常用的基因克隆载体u适用于构建原核生物基因文库、cDNA库和次级克隆质粒载体特点质粒载体特点有自主的有自主的复制起点复制起点两种以上的易于检测的两种以上的易于检测的选择性标记选择性标记多种限制性内切核酸酶的单一多种限制性内切核酸酶的单一酶切位点酶切位点适合适合小片段小片段DNADNA的重组的重组4040(2686 bp)4141（2）噬菌体DNA载体u由噬菌体DNA改造而成的具有自我复制能力的载体u最适用于构建真核生物基因文库和cDNA库42424343（3）黏粒载体u黏粒（cosmid）是一类人工构建的含有￿λ￿DNA黏端（cos序列）和质粒复制子的质粒载体，又称柯斯质粒。

u黏粒载体包括质粒的复制起点、抗性标记基因、多克隆位点和λDNA的cos位点，既可以转化大肠杆菌并按质粒复制的方式进行复制，又可以承载￿40Kb左右的外源DNA片段u常被用来构建高等生物基因文库u常见黏粒载体：pHC79、pJB8、c2RB、cosEMBL等444445454646（4）噬菌粒载体u噬菌粒（phagemid）是一类人工构建的有M13单链DNA的基因间隔区与质粒载体结合而成的基因载体u含有单链噬菌体包装序列、复制子以及质粒复制子、克隆位点、标记基因的特殊类型的载体u它兼具丝状噬菌体与质粒载体的优点4747u特点：l1.双链DNA既稳定又高产，具有常规质粒的特征；l2.免除了将外缘DNA片段从质粒亚克隆于噬菌体载体这一繁琐又费时的步骤；l3.由于载体足够小，故可得到长达10kb的外源DNA区段的单链u常见载体：pUC118、pCU119484849492.￿基因重组u基因重组（gene￿recombination）是在体外通过DNA连接酶的作用，将基因与载体DNA连接在一起形成重组DNA的技术过程l黏性末端连接l平头末端连接l修饰末端连接等5050（1）黏端连接￿u将载体DNA和目的基因用形成黏性末端(sticky￿ends)的同一种限制性内切核酸酶进行切割，形成黏性末端，按照1：1的比例混合，经过退火处理，使载体DNA与外源DNA的黏性末端结合，形成双链结合体；在T4￿DNA连接酶的作用下双链结合体连接形成稳定重组DNA分子。

51515252（2）平端连接u有些限制性内切酶（如HPa￿I，Sma￿I等）作用于DNA分子后，形成的末端是平端(blunt￿ends)u具有平端的质粒载体DNA和外源DNA分子，可以在T4￿DNA连接酶的作用下，形成重组DNA分子u重组效率比黏端连接低很多l提高外源DNA和质粒DNA浓度l提高T4￿DNA连接酶浓度l降低ATP浓度l避免亚精胺等多胺物质的存在53535454（4）修饰末端连接u当载体DNA和外源DNA的末端不相匹配时，T4￿DNA连接酶无法进行连接所以在连接之前，必须对两个末端或期中一个进行修饰处理，使两种DNA的末端互相匹配，以便于连接，形成重组DNAu主要的修饰方法是引进附加末端附加末端可以是单链DNA，也可以是双链DNA,可以在一个末端附加，也可以在两个末端都附加5555一端加接头（adapter￿or￿linker）5656两端加接头5757u同聚加尾法l分别给载体和插入片断加上互补的核苷酸非酶切位点非酶切位点58583.￿组装突变基因文库u突变文库的组装是将重组DNA转入受体细胞或包装成有感染活性的重组噬菌体的过程l对于重组质粒载体可以通过细胞转化等方法将重组DNA转入受体细胞，形成突变基因文库l对于重组噬菌体DNA载体，需要用噬菌体外壳蛋白将重组DNA进行包装，成为有感染活性的重组噬菌体，而形成基因文库。

7575u大肠杆菌转化（transformation)E. coli感受态细胞感受态细胞感受态制备感受态制备0℃℃，，0.1MCaCl2加入质粒加入质粒42℃℃热激热激90 s，，立即冰浴立即冰浴富裕培养富裕培养抗性筛选抗性筛选LB-抗生素抗生素7676u重组λ噬菌体转导（transduction)7878二、突变基因的筛选u根据定向进化的目的要求，在一定的环境条件下进行筛选，从突变基因文库中选取得到所需的突变基因突变基因文库突变基因文库质粒载体质粒载体噬菌体载体噬菌体载体转化转化转导转导目的基因目的基因筛选筛选8080（一）定向选择环境条件的设定u根据定向进化的设定选择环境u在每一次“突变——筛选”的循环中加以调整选择环境（1）提高酶的热稳定性：l较高温度下培养重组细胞，每次循环提高温度2）提高β-内酰胺酶的催化效率：l一定浓度的β-内酰胺类抗生素中培养，每次提高浓度8181细菌细菌诱发突变诱发突变的因素的因素5050 0 0C C培养培养突变体库突变体库选择压力选择压力耐受型突变体耐受型突变体一定浓度的一定浓度的β-内酰胺类内酰胺类抗生素抗生素8282（二）高通量筛选技术u高通量筛选技术要求：l通量大、效率高，在较短时间内简便的判断出正突变基因，并易于排出那些无效的突变基因。

u常用高通量筛选方法l平板筛选法平板筛选法l荧光筛选法荧光筛选法l噬菌体表面展示法噬菌体表面展示法l细胞表面展示法细胞表面展示法l核糖体表面展示法核糖体表面展示法838384841、平板筛选法u平板筛选方法是将含有随机突变基因的重组细胞，涂布在平板培养基上，在一定条件下培养，依据重组菌细胞的表型鉴定出有效突变基因的筛选方法u特点：l简便、快速、直观、容易控制和调整环境条件u依据：l重组细胞的表型细胞生长情况细胞生长情况颜色变化情况颜色变化情况透明圈情况透明圈情况8585（1）依据细胞生长情况筛选突变基因u热稳定性：温度梯度和高温环境u抗生素耐受性：抗生素浓度梯度upH稳定性：￿pH梯度u极端环境：高盐、低温、高浓毒物质8686（2）依据颜色变化筛选突变基因u反反应产物物显色色l蓝白斑白斑筛选（（Blue￿white￿screening）：：lacZlacZ’ ’AmN2H   片段片段片段片段COOHCOOH   片段片段片段片段8787（（LacZLacZ基因基因 N N端序列）端序列）插入片段插入片段（（LacZLacZ基因失活）基因失活）LacZLacZ基因基因 C C端序列端序列LacZLacZ酶酶-galactosidaseuBlue/￿white￿screening￿or￿Lac￿selection诱导物：诱导物：IPTG底物：底物：X-gal88888989l磷酸磷酸酯酶酶水解硝基酚磷酸生成水解硝基酚磷酸生成黄色硝基酚黄色硝基酚；；9090（3）￿根据透明圈情况筛选突变基因uStarch￿agar￿￿AmylaseuSpirit￿blue￿agar￿￿LipaseuMethylene￿blue￿tributyrin￿￿Lipase￿uSkim￿milk￿agar￿￿Caseinase￿uNutrient￿gelatin￿deep￿￿Gelatinase￿uDNase￿agar￿￿methyl￿green￿￿DNase￿9292u豆豉纤溶酶（douchi￿fiberolytic￿enzyme，DFE）u血纤维蛋白平板（blood￿agar）豆豉纤溶酶安全性能好，溶栓能力强，而且无毒副作用，不引起内出血，半衰期长。

93932、荧光筛选法u荧光筛选法是通过荧光产生与否以及荧光的强度情况进行突变基因筛选的方法u荧光筛选法通常将具有荧光激发特性物质的基因作为报告基因，与突变基因一起克隆到载体中，形成重组细胞，在突变基因表达的同时报告基因也进行表达，由于报告基因的表达产物可以激发荧光，所以通过检测荧光的产生情况，就可以或得能够在重组细胞中表达的突变基因，而将不能表达的无效基因排除9494u常见的报告基因l绿色荧光蛋白(GFP)lβ-半乳糖苷酶(lacZ)l氯霉素乙酰转移酶(CAT)l荧光素酶(luc)l碱性磷酸酪酶(SEAP)lβ-葡糖醛酸酶(GUS)等 9595巨细胞病巨细胞病巨细胞病巨细胞病毒启动子毒启动子毒启动子毒启动子 荧光素酶荧光素酶u荧光素酶(luc)9696u绿色荧光蛋白(GFP)该蛋白质在蓝色波长范该蛋白质在蓝色波长范围的光线激发下，会发围的光线激发下，会发出出绿色萤光绿色萤光9797uβ-半乳糖甘酶基因（lacZ）uONPG：邻硝基苯基-β-D-半乳糖苷，无色底物替代乳糖，uONP￿：邻硝基酚，亮黄色的亮黄色亮黄色亮黄色亮黄色无色无色无色无色无色无色无色无色420nm420nm检测检测检测检测9999100100u珊瑚虫荧光蛋白￿Anthozoan￿fluorescent￿proteinsu一种珊瑚虫Dendronephthya￿的双色荧光蛋白，当可见光中的蓝光照射时，发出的光芒由绿色转为红色。

￿101101u辣根过氧化物酶（HRP）基因与单加氧酶基因融合在一起作为报告基因，在有萘存在的条件下可以激发出荧光1021023、噬菌体表面展示法Phage￿surface￿display￿u噬菌体表面展示法是利用丝状噬菌体的外膜结构蛋白与某些特定的外源蛋白或多肽分子形成稳定的复合物，使目标外源蛋白或多肽富集在噬菌体表面的一种分子展示技术103103Ø噬菌体展示库建立过程Ø重组：重组：不同基因分别被插不同基因分别被插入噬菌体基因组中入噬菌体基因组中Ø分离纯化：分离纯化：纯化噬菌体只纯化噬菌体只是展示一个蛋白，多肽或者是展示一个蛋白，多肽或者抗体Ø文库建成：文库建成：收集所有的噬收集所有的噬菌体就构成一个文库将噬菌菌体就构成一个文库将噬菌体文库与靶蛋白相互作用，体文库与靶蛋白相互作用，筛选能与靶蛋白相互作用的筛选能与靶蛋白相互作用的噬菌体噬菌体105105u外源蛋白与噬菌体外膜结构蛋白的结合方法u一种是在构建突变基因文库时，通过基因重组技术，构建外源基因与噬菌体外膜蛋白基因的融合基因，融合基因表达生成外源蛋白与噬菌体外膜蛋白的融合蛋白，再通过噬菌体外膜蛋白的锚定作用而展示在噬菌体表面。

u另一种方法是外源基因与噬菌体外膜蛋白基因分别与可以相互作用的介导蛋白的基因形成融合基因，表达出来的两种融合蛋白可以通过介导蛋白的相互作用结合在一起，通过噬菌体外膜蛋白的锚定作用而展示在噬菌体表面106106pIIIForeign DNAMediating protein gene107107108108109109u淘洗方法：（亲和→洗脱→扩增→亲和）循环u淘选（Panning)u非筛选（Screening)PanningPanning1101101111114、细胞表面展示法u细胞表面展示法是通过可以锚定在细胞表面的特定蛋白质与某些外源蛋白质或多肽形成稳定的复合物，使这些外源蛋白或多肽富集在细胞表面的一种分子展示技术l酵母细胞表面展示法l细菌表面展示法113113（1）酵母表面展示法￿Yeast￿Surface￿Displayu酵母细胞表面展示法是通过锚定在酵母细胞表面的特定蛋白质（凝集素蛋白、絮凝素蛋白等）与某些外源蛋白或多肽形成稳定的复合物，使这些外源蛋白或多肽富集在酵母细胞表面的一种分子展示技术u目前已报道的酵母表面展示系统有三种,￿即目的蛋白分别与￿α凝集素、a凝集素或絮凝素融合后，展示于酵母细胞表面。

114114agα1Agα1u酵母凝集素的作用aga2aga1Aga1Aga2S SØMATα细胞中细胞中agα1基因编码基因编码α-凝集素（凝集素（α-agglutinin））Agα1ØMATa细胞中细胞中aga1和和aga2基基因分别因分别a-凝集素的两个亚基凝集素的两个亚基Aga1、、Aga2，二者通过，二者通过2对二对二硫键连接硫键连接ØMATα细胞和细胞和MATa可以通过可以通过Agα1和和Aga2的相互作用发生的相互作用发生凝集作用凝集作用（（agglutination），），在细胞交配中起到重要作用在细胞交配中起到重要作用α-cella-cell115115①￿目的蛋白-α凝集素表面展示系统u目的蛋白作为N端与α凝集素蛋白的C末端部分融合形成融合蛋白lα凝集素由￿Agα1￿基因编码，￿在加工前具有650个氨基酸l￿α￿凝集素￿Ｃ端有320个氨基酸残基，含有￿糖基磷酸酰肌醇（GPI￿）锚定信号序列￿119119120120②￿目的蛋白-a凝集素表面展示系统u目的蛋白以￿C￿端与￿a￿凝集素Aga2p￿亚基的N￿端融合进行表面展示u725￿个氨基酸残基的Aga1p￿亚基通过β葡聚糖的共价连接而锚定在细胞壁上。

u69￿个氨基酸残基的￿Aga2p￿亚基通过两对二硫键与￿Aga1p￿亚基相连￿,外源蛋白结果结合在a￿凝集素Aga2p￿的C端活性部位而展示在酵母表面121121122122123123③￿目的蛋白-絮凝素表面展示系统u目的蛋白作为N端与絮凝素蛋白的C末端部分融合形成融合蛋白u絮凝素（flocculin）是絮凝酵母表面的一种细胞壁蛋白，其C端含有GPI锚定附着信号系列，可以与细胞壁中的葡萄糖结合124124125125Flolp C端端GPI 锚定系统锚定系统Flolp N端絮凝结构域系统端絮凝结构域系统126126（2）细菌细胞表面展示法￿Bacterial￿Cell￿Surface￿Displau把外源基因与细胞表面结构蛋白基因融合，使目的蛋白锚定于细胞表面并获得活性表达的一种技术l革兰氏阴性菌表面展示技术l革兰氏阳性菌表面展示技术127127u革兰氏阴性菌表面展示技术u革兰氏阴性菌的外膜蛋白可以与细胞外膜结合u外源基因与革兰氏阴性菌外膜蛋白（LamB、OmpA、PhoE等）基因融合，融合基因表达的融合蛋白可以与细菌外膜结合，展示在细胞表面128128uGram(-)￿celldisplay systems : S-layer protein OmpC PhoA OprF OmpA lipoprotein IgA protease Pilin Lpp–OmpA INP Flagella129129Ice NucleationProtein (INP)outer membrane protein C （（OmpC））130130periplasmextracellularoutermembraneuLpp-OmpA￿surface￿displayJ. Francisco, C. Earhart, G. Georgiou, 1992Lpp(lipoprotein) signal peptideOmpA (outer membrane protein A)transmembrane domains (1 or 5)Surface protein131131u革兰氏阳性菌表面展示技术u某些抗原蛋白或表面受体蛋白具有锚定到革兰氏阳性菌表面的特性u将外源基因与某些抗原蛋白或表面受体蛋白的基因融合后，其表达的融合蛋白可以展示于细胞表面。

132132uGram(+)￿cellStaphylococalProtein AAlbumin binding protein白蛋白结合蛋白白蛋白结合蛋白 Charged repetitive region带电重复区域带电重复区域 1331335、核糖体表面展示法￿Ribosome￿Display，RDu是在体外合成、筛选和展示蛋白质的新技术u应用于功能蛋白、多肽及酶分子定向进化改造等领域u基本原理：l通过PCR扩增，获得DNA突变文库，置于具有偶联转录、翻译的系统中，由于翻译到终止密码子mRNA末端后，核糖体仍停留在mRNA的3’端而不脱离，使目的基因的翻译产物展示在核糖体表面，形成“mRNA一蛋白质一核糖体”的三元复合物，将基因型和表现型直接偶联起来，利用免疫学检测技术对复合体进行分析和筛选135135136136第三节￿酶分子定向进化的应用u酶分子定向进化的特点：l适应面广：P酶、R酶l目的性强：人工控制条件筛选l效果显著：能在短时间内获得自然界需要长时间完成的进化137137u某些酶定向进化结果目标酶所需功能方法结果实施菌种卡那霉素核苷基转移酶热稳定性定位诱变+选择在60-50℃酶半衰期增加200倍耐热脂肪芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶作用于有机溶剂易错PCR+选择在60％二甲基亚砜中活力增强170倍枯草杆菌β-内酰胺酶作用于新底物DNA改组+选择对cefotaxime的抗性增加32000倍大肠杆菌对硝基苯酯酶有机溶剂中的底物特异性和活性易错PCR+重组活力增加60-150倍大肠杆菌胸苷激酶第五特异性￿基因理疗交错延伸+选择活力增加43倍大肠杆菌β-半乳糖苷酶底物特异性DNA改组+选择活力增加66倍底物特异性增加1000倍大肠杆菌砷酸脱毒途径砷酸抗性DNA改组+选择抗性增加12倍大肠杆菌138138一、提高酶的催化活性u是定向进化的主要目标之一u例如：l1993年陈等人提高枯草杆菌蛋白酶E在有机溶剂中的催化效率（157倍）￿l1994年Stermer使β-内酰胺酶催化活性提高32000倍l1992年Beaudry等使四膜虫RNA剪切酶提高100倍139139二、增强酶的稳定性u提高酶稳定性的方法：l分子修饰l固定化l非水相介质催化l定向进化140140枯草杆菌蛋白酶E热稳定性的分子进化最适温度提高最适温度提高17℃℃，，65℃℃的半衰期延长的半衰期延长50-200倍倍141141三、改变酶的底物特异性u影响酶对底物的Km值，进而改变底物特异性u例如：l2000年，Aharoni等采用基因家族重排技术将大肠杆菌碱性磷酸酶对有机磷酸酯的特异性提高2000倍l2005年，冯志勇等采用易错PCR技术使β-糖苷酶失去原有的催化糖苷水解的活性，而呈现糖基转移酶的活性l2002年，Bartel使RNA剪切酶失去催化RNA分子剪切反应的特性，而呈现出将RNA和多肽链拼接在一起的催化特性。

142142143143思考题uuP173P173144144。