组织工程相关纳米生物材料.doc

第11章 组织工程相关纳米生物材料组织工程学(Tisｓｕe Engineｅring）一门多学科交叉的边缘学科，其研究涉及到细胞生物学、分子生物学、发育生物学、免疫学、临床医学、生物材料学、计算机科学等多个相关学科它是继细胞生物学和分子生物学之后，生命科学发展史上又一个新的里程碑,标志着医学将走出器官移植的范畴，步入制造组织和器官的新时代,人们试图通过组织工程学的研究,真正建造出替代人每一种组织甚至器官功能的生物性替代物它的提出、建立和发展是对医学领域组织、器官缺损和功能障碍传统治疗方法和模式的一次革命，孕育着巨大的科学价值和广阔的临床应用前景，是21世纪生命科学研究领域的焦点之一,必将产生巨大的社会和经济效益【1－２】目前国内外对组织工程学研究极为重视,组织工程相关产品正逐步形成高附加值的高科技产业,有些产品已开始进入临床如人工皮肤TｒａnsCｙte、Aplｉgraf、人工软骨ＣarｔicelTM等其它领域如骨、膀胱、血管、角膜、神经、输尿管、肝、胰、心脏瓣膜、血细胞、食管、肠管等的研究也正处于积极的实验阶段但是，目前组织工程研究尚存在许多基本问题亟待解决，主要表现在：①生命现象的本质及活动规律,即各种细胞、组织和器官的基本结构及其与功能的关系；②如何调控种子细胞的特异性粘附、增殖、定向分化以使其获得良好的生物学活性，充分发挥其特定的功能；③生长因子等组织诱导因子的大规模制备及持续控制释放；④具有良好表面相容性、结构相容性、适当生物降解性和特定生物活性的仿生“智能”基质材料的研制，以引发人们所需的特异性、可控性生物反应等等【3－4】。

纳米科技给上述问题的解决带来了新的发展机遇和它在生物医用材料领域中的意义与应用前景一样，纳米科技在组织工程学各领域的研究中也有重大的科学意义及广阔的应用前景，人们可以将纳米科技在其它领域的研究成果广泛地应用于组织工程学各相关领域【5—8】.组织工程学和纳米科技的有机结合，标志着组织工程学研究进入一个崭新的时代——纳米组织工程学时代.纳米组织工程学(Ｎａｎo tissuｅ enｇineering)就是将纳米科学与技术和组织工程学有机结合,从原子、分子水平认识细胞和组织的基本结构及其与功能的关系，阐明生命现象的本质及活动规律,并研制具有特定功能的仿生纳米装置和材料，为更好地恢复、维持或改善病损组织的功能奠定基础【1—４】.纳米组织工程学的首要任务是利用纳米科学的原理和技术，从原子、分子水平进一步深入认识真核细胞基因组的结构及功能调控、基因产物如何构建成细胞结构、如何调节和行使细胞功能等，从而认识各种细胞、组织和器官的基本结构及其与功能的关系，阐明生命现象的本质及活动规律然后从科学认识发展到工程技术，设计和制造出相应的纳米器件、纳米药物、纳米仿生“智能”基质材料，如纳米细胞监测器、纳米细胞清扫器、纳米细胞修复器、纳米细胞等,以更好地调控种子细胞的特异性粘附、增殖、定向分化等生物学行为,使其获得良好的生物学活性,实现良好的功能替代。

为最终解决目前组织工程学研究存在的基本问题提供强有力的技术支持【3—４】.在组织工程学研究中，细胞外基质替代物即基质材料的研究是一个至关重要的方面，是目前限制其发展和临床应用的一个瓶颈.如何研制出具有良好表面相容性、结构相容性、适当生物降解性和特定生物活性的仿生“智能"基质材料，以引发人们所需的特异性、可控性生物反应,是目前组织工程学研究亟待解决的关键性基本问题之一【9－１2】因此，大力研究和开发新一代组织工程相关纳米生物医用材料，是新世纪生物医用材料的重要发展方向，也是本章讨论的重点以下就对组织工程相关纳米生物材料的制备及表面仿生修饰予以介绍1１.1 纳米纤维支架材料的制备除可注射性材料以外，大多数组织工程支架必须预先制成多孔支架组织工程多孔基质材料应具有功能梯度结构，在三个尺度范围控制着细胞的生长发育过程.从制备方法上看，　解剖外形和尺寸（ｍm-ｃm）则取决于成型方法,而大孔尺寸(～102μm）、孔壁尺寸（~μm）、孔壁内微细结构（如微纤,微孔,50～５00nm)取决于致孔方法纳米材料制备技术可以对基质材料表面的纳米结构(nｍ)进行设计和加工纳米材料中的维数概念与一般材料科学中的维数有所不同，纳米材料根据维数的不同分为三类：①零维材料指空间三维从尺度均为纳米尺度的材料,如纳米颗粒。

②一维材料指空间尺度有两维处于纳米尺度的材料，如纳米棒③二维材料指空间尺度有一维处于纳米尺度的材料,如超薄层从多孔支架的孔形态上看,主要有纤维、多孔海绵/泡沫、相连管状结构等三种，其中纤维支架是组织工程研究中最早采用的细胞外基质替代物之一.在典型的结缔组织中,结构蛋白纤维，如胶原纤维和弹性蛋白纤维的直径从几十纳米到几百纳米,这些纳米级蛋白纤维相互交缠，形成非编织状的网,为组织提供拉力和弹力粘连蛋白，如纤维结合蛋白、层粘连蛋白为细胞的黏附提供特殊的结合位点纳米纤维支架有较高的表面与体积比,它可以大大增加细胞的黏附，从而可以增加细胞的迁移，增殖及分化功能.因此，纳米纤维支架较传统的支架更有发展前途【13-１5】，也是本章讨论的重点11.１1 纳米纤维支架材料的制备有三种方法合成这种纳米纤维支架材料：自组装技术,电子纺丝技术，相分离技术.1 自组装技术应用分子自组装技术,依靠分子间非共价键的键合作用制备超分子纳米材料在材料表面通过非共价键形成自组装膜,吸附分子存在时，局部形成的无序单层可以自我再生,生成更完善的有序体系，具有较大的流动性和可变形性，赋予适宜细胞生长的材料表面拓扑结构.用自组装技术合成纳米级超分子结构，也可合成纳米纤维【１5】.为了模拟形成天然骨的纳米结构， Stupp等【16—19】应用pＨ控制的自组装技术设计合成了一种两亲性多肽（ＰA）， 可以自组装生成纳米结构纤维支架。

这种圆锥形的两亲性多肽主要包括5　个基本的化学结构特征： （1） 长的疏水烃基尾端;　(2）　含有４个连续的半胱氨酸残基,通过氧化反应,半胱氨酸上的SH基团可与另外一条多肽链上SＨ自组装形成二硫键,从而使多肽链形成牢固的高级结构； (3) 含三个甘氨酸的交连部分，以提供亲水性的头基与坚硬的交联区域的结合； （4） 磷酸化的丝氨酸位点，这些位点带有大量负电荷，可以诱导钙离子沉积、成核生长并自组装而成纳米晶HA;　(5） 含有细胞结合配体序列Aｒg-Glｙ—A　sp(ＲGD)，可促进种子细胞的黏附其中,半胱氨酸，磷酸纤维化的丝氨酸以及RGD序列是PA肽链的特征性结构（图11－１)由于ＰAs有圆锥状结构和两性分子的特点,可以自组装形成圆柱状纳米纤维，　纳米纤维直径约为76nm，长度超过1µm(图1１－２）.在结构方面，两亲性多肽链与纳米纤维垂直，疏水端包裹在长柱状结构内部，亲水端暴露在长柱状结构的表面这与天然胶原基质有所不同,在天然胶原中其排列呈平行状在pH＝8时将二硫苏糖醇注入ＰAｓ,然后调整pＨ＝4，酸化的PAｓ很快自组装交联固化而形成纳米纤维这种离散型纳米纤维能通过氧化生成二硫键发生交联达到材料的自组装, 同时也能通过自由巯基的释放来控制自组装的可逆过程;　生成的纳米纤维可相互交织形成网状结构,　宏观呈凝胶状。

研究表明, 提供足够量的酸性磷酸化丝氨酸和天门冬氨酸能促进初始ＨＡ 的成核,　将此凝胶浸入钙磷酸盐缓冲溶液中,表面充满带负电荷酸性氨基酸的纳米纤维可通过建立局部的过饱和离子环境促进自身矿化生成纳米HＡ晶体，　这些矿化的纳米纤维中Ca/P比率为１67±0.08， 而且晶体学上的HＡ c　轴沿胶原纤维长轴定向排列， 类似与自然骨最基本的形态学结构图11—1两亲性多肽（PA）图１１—2两亲性多肽自组装形成圆柱状纳米纤维,　纳米纤维直径约为7.6nｍﻬ 　 胶原是一种三股螺旋超二级结构,它由三条左旋的多肽链组成Ｆiｅldｓ　等用一种两亲性多肽（PＡ）分子去模拟这种结构ＰＡ由a1(ＩV）１２６3—1２77胶原序列Ｇly—Val-Ｇly－Asp－Ｌys-Asn-Prｏ-Gｌy—Ｔｒｐ-Pro－Glｙ—Ａla－Pｒo（IV—HI)结合一个长链单或双羟基脂质（１4－１8）组成胶原序列的头端组成了三维螺旋结构，而亲脂的尾部与疏水端相结合以诱发和稳定胶原序列头端的三维结构，并且因它的长度和分支不同而影响PA超分子结构的热稳定性在生理条件下,（ＩV—HI）PＡｓ可以自组装成三股螺旋状结构在（IV—HＩ）PＡ中培养黑色素瘤细胞，以检测与细胞黏附,展开及信号传导有关的生物学特性。

发现PA能明显诱导细胞黏附.细胞的展开在50%molar的(ＩV-HＩ）ＰA双分子层及(C18)２－Glu－C２-ＣOOＨ3亲水分子面明显增加.这种三股螺旋构象的稳定性可以影响细胞的黏附及展开【2０-２1】.在酸性分泌蛋白序列的基础上研发了嵌合体ＰA特点是其富含半胱氨酸,即富含半胱氨酸酸性分泌蛋白（ＳPARC）.其能促进细胞增殖及血管发生上皮细胞被用来检测ＳＰARC PA的生物活性.SPARＣ PA自身能轻微地促进细胞的黏附和伸展，当它与C10－（a１（Ｉ）49６-5０7）混合时，它可以明显地促进细胞黏附和展开，其水平相当于I型胶原 2 　电子纺丝技术【２2】电子纺丝技术是通过在聚合体溶液/融液中加入电荷悬浮微粒而制成超细的纳米纤维1934年Formhalｓ首先申请了电子纺丝技术的专利.其原理是利用电流使得聚合体溶解/融化，再由收集器收集，聚合体溶液/融液要在收集器中固化，在收集器的顶端通过重力或机械泵产生悬浮微粒,用（１０－20KＶ）的高电压产生足够的静电荷，当静电荷克服了微粒的表面张力后聚合体溶液/融液就喷出了随着溶剂的蒸发,表面电荷密度增加，喷射流越来越细,纳米纤维雏形形成在喷射物干燥的过程中，喷射物中静电荷的放射状力量远远大于喷射物中的内聚力，这些导致聚合物扩展或分解成直径相同的小的喷射物和电位电荷,这些小的喷射物最终在金属样本收集器上形成纳米纤维【２3－24】.在电子纺丝技术中寻找合适的溶剂相当困难。

ＨFP是静电纤维缠绕技术中溶解蛋白质的常用溶剂溶解丝蛋白用甲醇作溶剂静电纤维缠绕技术中丝蛋白可以在水中与PＥＯ混合，然后用甲醇洗涤，除去PＥO.Ｈuaｎg等用基因工程的方法合成一条含多次重复的弹力蛋白多肽链，(Val－Pro－Gly-Vａl—Glｙ）4（Val－Pro-Gly-Ｌys-Gly)这条多肽溶解在水中,在适当条件下用静电纤维缠绕技术合成直径200—３00nｍ的纳米纤维.Fang报道用小牛胸腺钠－DNA水溶液合成直径50-８０ nm的纳米纤维【2５】目前，利用电子纺丝技术开发生物医用材料制品已成为研究的热点研究的方向主要集中在两方面：一是利用电子纺丝制备的纳米级纤维,作为细胞支架、药物等添加剂的载以及纳米级仿生材料等.二是改变收集方法以获得薄膜及管状物等功能性形态结构,可广泛用于伤口包覆材料、功能性膜、人造导管等【2６－2７】 现在组织工程中广泛应用的生物材料多是由电子纺丝技术制成的纳米纤维.典型的生物可降解聚合物PLGA或PCL，水溶性生物材料如ＰEO、PVA用水或有机溶剂很容易被电子纺丝法制成纳米纤维，PLＧＡ及ＰCL纤维的直径分别为５00－80０ｎｍ及2０0－600ｎｍ，PLGＡ无纺三维多孔支架的孔隙率〉９０%（图1１—３）。

Ⅰ型胶原纤维的平均直径２50nm,天然的聚合体，如:胶原,丝蛋白,弹力蛋白衍生肽,纤维蛋白原，酪蛋白及脂肪酶甚至DＮＡ都可以用电子纺丝技术处理，生成纳米纤维一个有趣的现象是静电纤维缠绕技术生成的Ⅰ型胶原纳米纤维的６7－nm现色带为典型的天然胶原纤维Faｎg等【２8】用1mg 的小牛胸腺Na　－　DNＡ 溶液(浓度0.3　–　1．５ ％),通过电子纺丝制备了50 - ８0ｎｍ纳米纤维图11-3 电子纺丝法制备的ＰＬGA纳米纤维，直径为500－8０0nm，孔隙率>９０％从生物学角度看,人体几。