研究原卟啉钠体内外抗乙肝病毒作用药学论文.doc

研究原卟啉钠体内外抗乙肝病毒作用_药学论文 摘要：　目的观察原卟啉钠体内外抗乙肝病毒作用方法体内实验采用先天感染鸭乙肝模型，检测给药前、给药后5 d、10天及停药后3 d鸭血清 DHBV-DNA的动态变化；体外实验采用2.2.15细胞为模型，检测用药后对细胞培养上清液中HBsAg和HBeAg的抑制作用结果体内实验显示，给药第5，10 d时鸭血清DHBV-DNA其OD值均明显低于给药前，差异有显著性意义(P<0.05)；体外实验显示，原卟啉钠在所稀释的各浓度下，对细胞分泌HBsAg，HBeAg均有一定的抑制作用，对HBsAg，HBeAg的治疗指数分别大于188.7和64.5结论原卟啉钠体内外均具有明显的抗乙肝病毒作用 关键词： 原卟啉钠 鸭乙型肝炎病毒 2.2.15细胞株　　　抗病毒治疗目前是治疗乙型病毒性肝炎的关键，而现有的抗病毒药物多数具有治疗后长期应答率不够理想以及较多的副作用等问题，所以寻找新的、高效低毒抗乙肝病毒药物就显得尤为重要，原卟啉钠分子式C34H32N4O4Na2，化学名为1，3，5，8-四甲基-2，4二乙烯基卟吩-6，7-二丙酸钠(Protoporphyrin Disodium NAPP)，是由四个吡咯环经四个次甲基键连接而成的含共扼双键的大环化合物，可由血红蛋白的辅基血红素经人工提取、加工而成的。

近年来有研究报道，NAPP体外具有抗乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）的作用［1］为了进一步明确其抗病毒效果，本研究对NAPP体内外抗HBV作用进行了实验研究现报道如下　　1 材料　　1.1 药物 　　原卟啉钠（NAPP），本实验室提取，纯度94.1%；拉米夫定葛兰素史克制药（苏州）有限公司生产，批准文号：国药准字H20030581　　1.2 动物　　　1 日龄龙岩麻鸭 35只，雄性，体重（50±5）g，购自石井潮阳村孵化场，常规饲养饲料：宝鼎501小鸭饲料，由穗屏企业有限公司饲料厂生产　　1.3 试剂　　　缺口翻译平移试剂盒购自美国 Promega CO公司；α-32P- dCTP 购自北京市亚辉生物医学工程公司；NC膜购自Amersham公司；DHBV质粒由广州中医药大学热带病研究所病毒室保存；Sephadex G-50购自Pharmacia公司； MEM干粉、胎牛血清购自GIBCO公司； HBsAg，HBeAg 抗原检测试剂盒购自上海科华生物工程公司；MTT检测试剂盒购自北京碧云天公司；PCR试剂盒购自华美生物工程公司　　1.4 HepG 2.2.15 细胞 　　　引自上海复旦大学医学院分子病毒实验室。

　　2 方法　　2.1 体内实验　　2.1.1 动物的分组及给药方法1日龄龙岩麻鸭购回后喂养2 d后，自胫静脉取血，离心，收集血清，用斑点杂交的方法检测DHBV-DNA，第13天出结果，筛选出先天自然感染鸭后进行下一步实验将DHBV-DNA阳性鸭随机分为3组：模型组、拉米夫定组和NAPP组，每组8只NAPP组和拉米夫定组每天按20 mg/（kg·d）剂量口服给药，模型组以生理盐水代替药物，连续给药10 d分别于给药前、给药后5 d、给药后10 d及停药后第3天采集血样，分离血清，-70℃冻存待检2.1.2 鸭血清DHBV-DNA的检测 　　采用 DHBV-DNA Dot Blot法测定［2］取上述鸭血清，每批同时点膜，测定鸭血清中DHBV-DNA水平，观察其动态变化按缺口翻译试剂盒说明书方法，用32P标记DHBV-DNA探针，将40 μl血清点于硝酸纤维膜上，然后杂交，放射自显影，在酶标检测仪上测定OD值（滤光片波长为490 nm）　　2.2 体外实验　　2.2.1 细胞毒性检测根据Mosmann等建立的四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法（MTT法）检测药物细胞毒性具体方法：用胰酶消化HepG 2.2.15细胞后，调整细胞浓度至2×104 cell/ml，加入96孔培养板中，每孔100 μl，每个浓度设3孔，培养24 d，吸去上清后加入含有不同浓度药物（1 ，10-1，10-2，10-3，10-4 mg/ml）的DMEM培养基。

作用72 d之后，各孔中加入10 μl的MTT并继续培养4 h，去上清，每孔加入100 μl DMSO，轻轻振荡使甲臜溶解，测570 nm波长下吸光度的OD值计算细胞存活率和各种药物的半数毒性浓度TC50，TC50是实验组存活细胞为对照组的50%时的药物浓度细胞存活率（%）=［（OD实验孔－OD空白对照）／（OD细胞对照－OD空白对照）］×100%，TC50= Antilog［ B + (50-<50%破坏百分率) ×C / （>50%破坏百分率-<50%破坏百分率）］　　C = A - B，A = log>50%药物浓度 B = log <50%药物浓度　　2.2.2 药物对细胞分泌的HBsAg、HBeAg抑制作用 HepG 2.2.1 5细胞胰酶消化后，接种于24孔培养板，每孔1 ml，培养4 d后换用含药培养液，并设拉米夫定为阳性对照组根据药物毒性实验结果，确定药物的浓度，每浓度加3孔，同时设不加药细胞对照3孔及培养液空白对照3孔，并于第3，6天更换新鲜的含药液培养，第9天收集各孔细胞上清液，-20℃冷冻采用ELISA法检测上清液中HBsAg，HBeAg药物对抗原的抑制百分率（%）=［（OD细胞对照－OD实验孔）／（OD细胞对照－OD空白对照）］×100%，IC50为HBsAg，HBeAg抑制率为50%时的药物浓度。

治疗指数TI=TC50/IC50　　2.3 统计学处理　　　F分析配对t检验 采用SPSS11.5软件包进行统计分析　　3 结果　　3.1 体内实验各实验组用药后不同时间光密度值与同组给药前光密度值的比较见表1）NAPP组在给药后第5天鸭血清DHBV-DNA水平有较明显下降，与给药前自身比较，差异有显著性(P<0.05)，第10天与给药前自身比较，差异有显著性意义(P<0.01)拉米夫定组在给药后第5天DHBV-DNA水平明显下降，与给药前自身比较，差异有显著性意义(P<0.01)表1 NAPP对鸭乙肝模型血清病毒滴度的抑制作用(略)　　3.2 体外实验NAPP对HepG 2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg的抑制作用见表2～3由表2可知，NAPP和拉米夫定的各浓度组与细胞对照组相比H 。