砒霜纳米乳治疗小鼠Lewis肺癌的效果初步评价药学论文.doc

砒霜纳米乳治疗小鼠Lewis肺癌的效果初步评价_药学论文 作者：许严伟 ，杜钢军，林海红，宋紫辉，张硕，王梅【摘要】 　　目的评价砒霜纳米乳 治疗 小鼠Lewis肺癌的效果及对免疫系统的毒性 方法采用MTT法及流式细胞仪分别检测A549细胞的增殖和凋亡；采用小鼠Lewis肺癌皮下移植肿瘤模型观察砒霜的抗肿瘤作用，通过小鼠碳粒廓清和迟发性变态反应考察砒霜对免疫系统的毒性结果砒霜纳米乳可诱导A549细胞的凋亡，流式结果出现DNA亚二倍体凋亡峰；砒霜纳米乳与其水溶液连续灌胃给药8 d对小鼠Lewis肺癌皮下肿瘤的抑瘤率分别为42.0%和33.2%，砒霜水溶液对小鼠碳粒廓清能力及迟发性变态反应均有降低作用，但其纳米乳对两者均无明显影响结论砒霜纳米乳对小鼠Lewis肺癌皮下肿瘤的效果优于其等剂量水溶液，且能降低对机体免疫系统的损害 【关键词】 砒霜纳米乳 Lewis肺癌 免疫　　Abstract:Objective To evaluate the therapeutic action of arsenic nano-emulsion on Lewis lung cancer and its toxicity to immunity .MethodsThe proliferation and cell cycle of A549 cells were determined by MTT assay and flow cytometry respectively. The antitumor of arsenic was tested by tumor injected subcutaneously in mice and its toxicity to immunity was examined by clearance rate of charcoal particles and delayed type hypersensitivity.ResultsArsenic nano-emulsion and its water solution taken orally for eight days had respectively 42.0% and 33.2% inhibition on lewis lung cancer. The clearance rate of charcoal particles and delayed type hypersensitivity were depressed by arsenic water solution but not by arsenic nano-emulsion in mice. ConclusionArsenic nano-emulsion has better therapeutic action on Lewis lung cancer than arsenic water solution does at the same dose, and it also reduces toxicity to immunity.　　Key words:Arsenic nanoemulsion； Lewis lung cancer；Immunity　　肿瘤在人类死亡的主要疾病中居第2位，近年来发病率呈逐年上升趋势［1］。

尽管目前已有多种治疗肿瘤的方法问世，由于肿瘤早期不易被发现的特点，化疗在肿瘤的治疗中一直处于主导地位但因目前化疗药物对肿瘤的杀伤缺乏选择性，在杀死肿瘤细胞的同时对机体的正常细胞也产生较大毒性，临床上往往因病人不能耐受化疗药物的毒性最终导致肿瘤治疗失败［2］中药砒霜在祖国医学中曾被用于治疗恶性肿瘤等多种疾病，但由于它是一种剧毒物质，其药用价值一直被其毒副作用所掩盖自1996年《Science》杂志报道［3］的三氧化二砷（As2O3）成功治愈急性早幼粒细胞性白血病(APL)的成果以来，对As2O3药理作用的探索引起了世界医学界的重视，在我国对砒霜的研究也成为开发抗肿瘤药物的热点之一［4］我们将砒霜制成纳米乳剂，以发病率较高的肺癌为肿瘤对象，研究砒霜的抗肿瘤作用及其对免疫功能的损害，以期探索更好利用砒霜的新途径　　 1 材料与仪器 　　1.1 动物C57B/6小鼠，雌性，18～22 g，购自北京维通利华实验动物有限公司；昆明种小鼠，雌性 18～22 g，购自河南省实验动物中心　　1.2 瘤株Lewis肺癌细胞，购于上海细胞所，本实验室C57BL/6小鼠传代保存；A549细胞， 中国 科学 院生物物理研究所惠赠，用含10%胎牛血清和青霉素、链霉素各100 U/ml的RPMI-1640在37℃， 5%CO2 恒温培养箱中培养,实验时选用对数生长期的细胞。

　　1.3 试剂与药品RPMI-1640和MTT，Sigma产品；胎牛血清，杭州四季青公司； 司盘80，国药集团化学试剂有限公司生产， 批号F20061117；吐温80，天津市红岩化学试剂厂生产， 批号060824； 印度墨汁，北京笃信精细制剂厂生产， 批号040823；DNCB，上海华硕精细化学品有限公司生产， 批号040928；砒霜，河南大学一附院中药房提供　　1.4 仪器　　100级洁净工作台，上海博迅实业有限公司医疗设备厂生产； KQ-500DB型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；TDL-50B型台式离心机，上海安亭科学仪器厂生产；XD-101型倒置生物显微镜，南京江南光电（集团）股份有限公司；ELX800型酶标仪，美国BIO-TEK流式细胞仪，美国BD公司　　 2 方法 　　2. 1 纳米乳的制备［5］称取砒霜80 mg加入到2 ml碱性蒸馏水中（0.1M NaOH），使其完全溶解,无菌过滤后作为水相取4∶1∶1比例的灭菌豆油、司盘80和吐温80，使其混匀溶解后加入水相，加热至50℃，以适量5M柠檬酸溶液调节pH值至7.0～7.5超声波振荡器振荡1 h即得均一透明纳米乳，100×油镜下估计1 μm内约20个乳滴。

同时以同样量的水相制备空白纳米乳　　2. 2 MTT检测［6］取对数生长期的A549细胞,用0.25%的胰酶消化, 调细胞数5×104/ml, 以100 μl/孔接种于96孔板中,培养24 h后加补充含不同浓度砒霜（纳米乳或水溶液）的培养基100 μl/孔,每组6个复孔48 h后，除去培养基，加含MTT 5mg/ml的PBS 100 μl/孔，继续培养4 h后除去孔内的液体,加入DMSO 100 μl/ 孔,振荡10 min,在酶标仪上570 nm处测吸光度 (OD) ,按下式 计算 细胞的存活率： 　　存活率(%) =给药孔平均OD 值对照孔平均OD 值×100%　　2.3 流式细胞仪检测取对数生长期A549细胞, 用0.25%的胰酶消化, 调细胞数3×105/ml, 以3 ml/瓶接种于培养瓶中,培养24 h后加补充含不同浓度砒霜（纳米乳）的培养基3 ml/瓶,每组3个复瓶48 h后终止培养,消化并收集细胞，PBS洗2次, 70%冷乙醇固定30 min PBS洗涤2次后加入Rnase酶消化10 min, 1 500 r/min离心5 min,弃上清液，PBS重悬后加碘化丙锭（终浓度20μg/ml）染色15 min ,流式细胞仪分析细胞凋亡。

　　2.4 对小鼠Lewis肺癌皮下肿瘤生长的影响［7］ 取生长良好的Lewis肺癌细胞，用生理盐水研磨成细胞匀浆，调细胞数5×106/ml， 0.2 ml/只接种于30只C57BL/6小鼠右前肢腋部皮下，待肿瘤长出约0.5 g后分组给药: 对照组：灌胃空白纳米乳（10 ml/kg）；砒霜水溶液组：灌胃砒霜水溶液（30 mg/kg）；砒霜纳米乳组：灌胃砒霜纳米乳（30 mg/kg）每组10只小鼠，各组均每日给药1次，连续给药8 d自给药当天开始，每隔1 d测肿瘤直径1次治疗结束后次日处死小鼠，剥离肿瘤，称重，按公式计算抑瘤率　　抑瘤率(%)=(1- C/T)×100%　　式中：C为对照组平均瘤重（g）；T为实验组平均瘤重（g） 　　2.5 碳粒廓清实验［8］雌性昆明小鼠30只，随机分为3组，每组10只对照组：灌胃空白纳米乳（10 ml/kg）；砒霜水溶液组：灌胃砒霜水溶液（30 mg/kg）；砒霜纳米乳组：灌胃砒霜纳米乳（30 mg/kg）各组均给药1次/d，连续给药10 d，末次给药后1 h小鼠尾静脉注射稀释的印度墨汁0.1 ml/10 g，注射后1 min和10 min分别从小鼠眶静脉采血20 μl，吹入2 ml 0.1%NaHCO3溶液中，以等容量小鼠正常血溶于2 ml 0.1%NaHCO3溶液作为空白，用ELX800型酶标仪630 nm测吸收度（A）， 计算 吞噬指数K。

将小鼠处死，称取脾脏、胸腺及肝脏重量，计算各脏器系数　　吞噬指数K=（lgA1－lgA2）/（T2－T1）　　（A1，A2分别为1 min和10 min的吸光度，T1，T2分别为1 min和10 min）　　脏器系数=脏器重量/体重　　2.6 迟发性变态反应实验［9］雌性昆明小鼠30只，随机分为3组，每组10只，给药方法同“2.5”项第1天用7%DNCB 20 μl/只滴于小鼠背部致敏激发，激发后次日开始给药，1次/d，连续给药10 d末次给药后6 h，右耳涂30 μl 7%DNCB，左耳涂等容量丙酮对小鼠致敏攻击16 h后将小鼠处死，剪下两耳，用9 mm打孔器打下耳片，称重，计算耳肿胀　　耳肿胀=右耳片重量-左耳片重量　　2.7 统计方式数据以±s表示，用EXCEL自动计算组间差异采用student's t检验， P＜0.05为有显著性差异，P＜0.01为有非常显著性差异　　 3 结果 　　3.1 对A549细胞的影响砒霜水溶液和砒霜纳米乳对体外培养的A549细胞均有明显的增殖抑制作用，且抑制作用随药物浓度的增加而增加；砒霜纳米乳对细胞的抑制作用略高于砒霜水溶液，但无统计学差异(见图1)；经砒霜纳米乳处理的细胞出现典型的亚二倍体“凋亡峰”，随着药物浓度的升高凋亡率逐渐增加,在砒霜浓度为10 μmol/L时，细胞凋亡现象最为显著。

见图2　　3.2 对Lewis肺癌皮下肿瘤的影响与对照组（空白纳米乳）比较，砒霜纳米乳和水溶液对小鼠Lewis肺癌均有明显抑制作用，可以减慢肿瘤生长速度(P<0.01)，降低肿瘤大小(P<0.01)， 治疗 结束时的肿瘤抑制率分别为42.0%和33.2%结果见图3与表1 表1 砒霜纳米乳对小鼠Lewis肺癌皮下肿瘤大小的影响（略）　　3.3 对小鼠碳粒廓清和迟发性变态反应的影响砒霜水溶液对小鼠碳粒廓清能力及迟发性变态反应均有抑制作用，增大肝脏指数，降低脾脏指数、胸腺指数和耳肿胀，但其纳米乳对上述指标均无明显影响结果见表2表2 砒霜纳米乳对小鼠碳粒廓清和迟发性变态反应的影响（略）　　 4 讨论　　纳米乳(nano-emulsion)是粒径为10～100 nm的乳滴分散在另一种液体中形成的胶体分散系统，属热力学稳定系统［10］作为一种新型药物传递系统，纳米乳在提高药物溶解度、增加药物稳定性、降低药物副作用、缓控释给药和基因传输等方面有着广泛的应用，其主要优点是毒性小、安全性高、不需特殊设备即可大量生产等［11］砒霜对多种恶性血液病和实体瘤的治疗作用不仅在实验室得以证实，而且已经逐步应用于临床，其抗肿瘤作用主要表现为：①诱导肿瘤细胞凋亡；②抑制肿瘤细胞增殖；③诱导肿瘤细胞分化；④抑制肿瘤细胞转移。

但作为一种剧毒药物，砒霜在抗肿瘤方面尚有许多问题未解决，如动物实验与临床治疗反应是否一致，不同的肿瘤所需治疗剂量是否相同，砒霜治疗恶性肿瘤的最佳给药途径、剂量、时间间隔、疗程以及如何防止砒霜在治疗过程中中毒等由于纳米乳与其。