实验四PCR及电泳技术ppt课件.ppt

及及电泳技泳技术4 PCR实验1. PCR1. PCR的根本原理的根本原理•PCR根本原理根本原理 类似于似于DNA的体内复制在模板的体内复制在模板DNA、引物和、引物和4种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸存在条件下依存在条件下依赖于于DNA聚合聚合酶的的酶促合成反响促合成反响•PCR的根本步聚　的根本步聚　 •　　1、、变性性 (Denaturation) ：：经过加加热使使DNA双螺旋的双螺旋的氢键断裂，双断裂，双链解离解离构成构成单链DNA • 2、退火、退火 (Annealing) ：当温度忽然降低：当温度忽然降低时，反响体系中引物和其互，反响体系中引物和其互补的的DNA模板在部分构成模板在部分构成杂交交链 • 3、延伸、延伸 (Extension )：在：在DNA聚合聚合酶和和4种脱氧核苷酸种脱氧核苷酸(dATP、、dCTP、、dGTP、、dTTP)及及Mg2+存在条件下，存在条件下，5’→3’的聚合的聚合酶催化以引物催化以引物为起始点的起始点的DNA链延伸反响延伸反响•  这种种热变性性-复性复性-延伸的延伸的过程就是一个程就是一个PCR循循环，，PCR就是在适宜条就是在适宜条件下的件下的这种循种循环的不断反复。

的不断反复PCR Cycle - Step 1 - Denaturation Template DNA by Heat (95℃)Target SequenceTarget SequencePCR原理表示图原理表示图①① 模板模板DNA的的变性：模板性：模板DNA经加加热至至93℃左右一定左右一定时间后，使后，使模板模板DNA双双链或或经PCR扩增构成的双增构成的双链DNA解离，使之成解离，使之成为单链，，以便它与引物以便它与引物结合，合，为下下轮反响作反响作预备；；5’3’3’5’ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGCTAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG5’3’3’5’ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGCTAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG加加热94℃℃引物酶②② 模板模板DNA与引物的退火与引物的退火(复性复性)：模板：模板DNA经加加热变性成性成单链后，后，温度降至温度降至55℃左右，引物与模板左右，引物与模板DNA单链的互的互补序列配序列配对结合；合；PCR Cycle - Step 2 –Temperature is lowered (Tm ) and primers anneal to target sequencesTarget SequenceTarget SequencePrimer 1Primer 25’3’5’5’3’5’3’3’引物酶3’5’3’5’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG引物ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC引物3’5’5’3’PCR Cycle - Step 3 - At 72 ℃ Taq DNA polymerase catalyses primer extension as complementary nucleotides are incorporatedTarget SequenceTarget SequencePrimer 1Primer 25’3’5’5’3’5’3’3’Taq DNAPolymerase③③ 引物的延伸：引物的延伸：DNA模板模板--引物引物结合物在合物在Taq DNA聚合聚合酶的作用下，的作用下，以以dNTP为反响原料，靶序列反响原料，靶序列为模板，按碱基配模板，按碱基配对与半保管复制原与半保管复制原理，合成一条新的与模板理，合成一条新的与模板DNA 链。

3’5’3’5’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCGATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGCATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGCDNA聚合酶TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCGDNA聚合酶5’5’3’3’引物引物End of the 1st PCR Cycle –Results in two copies of target sequenceTarget SequenceTarget Sequence 每完成一个循环需每完成一个循环需2-4 min，， 2-3 h就能将待扩目的基因扩增放大就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍几百万倍3’5’3’5’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCGATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGCATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGCTAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG5’5’3’3’Target AmplificationNo. ofNo. Amplicon CyclesCopies of Target122438416532664201,048,576301,073,741,8241 cycle = 2 Amplicon2 cycle = 4 Amplicon3 cycle = 8 Amplicon4 cycle = 16 Amplicon5 cycle = 32 Amplicon6 cycle = 64 Amplicon7 cycle = 128 AmpliconPCR仪PCR仪PCR仪1、PCR反响成分1 1〕模板〕模板 单单、双、双链链DNADNA或或RNARNA都可以作都可以作为为PCRPCR的的样样品。

假品假设设起始起始资资料料是是RNARNA，，须须先先经过经过逆逆转录转录得到第一条得到第一条cDNAcDNA 普通普通100ng DNA100ng DNA模板模板/100/100l l模板浓浓度度过过高会高会导导致反响致反响的非特异性添加最好做的非特异性添加最好做浓浓度梯度度梯度对对照从而确定最正确条件照从而确定最正确条件PCR反响体系模板模板引物引物Taq DNATaq DNA聚合聚合酶4 4种种dNTPdNTP混合物混合物Mg2+Mg2+10×10×缓冲液冲液2〕引物 〔1〕浓度 0.1-0.5 M 浓度过高易导致模板与引物错配，反响特异性下降•引物是引物是PCRPCR特异性反响的关键；特异性反响的关键；•PCRPCR产物的特异性取决于引物与模板脱氧核糖核酸互补的程度；产物的特异性取决于引物与模板脱氧核糖核酸互补的程度；•人工合成的寡聚核苷酸引物需经离子交换人工合成的寡聚核苷酸引物需经离子交换HPLCHPLC进展纯化进展纯化3 3 3 3〕〕〕〕Taq DNATaq DNATaq DNATaq DNA聚合聚合聚合聚合酶酶普通普通普通普通0.5-2.5 U/500.5-2.5 U/500.5-2.5 U/500.5-2.5 U/50l l l l；；；；酶酶量量量量过过少影响反响少影响反响少影响反响少影响反响产产量；量；量；量；浓浓度度度度过过高可引起会呵斥高可引起会呵斥高可引起会呵斥高可引起会呵斥杂带杂带、特、特、特、特异异异异产产物物物物带带不明晰等不好的不明晰等不好的不明晰等不好的不明晰等不好的结结果，果，果，果，浓浓度度度度过过低那么得不到所低那么得不到所低那么得不到所低那么得不到所需的需的需的需的产产物。

最可靠的做法是先做物最可靠的做法是先做物最可靠的做法是先做物最可靠的做法是先做浓浓度度度度对对照照照照, , , ,再根据再根据再根据再根据结结果果果果断定最正确条件断定最正确条件断定最正确条件断定最正确条件4 4〕〕dNTP (dATPdNTP (dATP、、dCTPdCTP、、dGTPdGTP、、dTTP 4dTTP 4〕〕 dNTP dNTP浓度取决于度取决于扩增片段的增片段的长度度; ; 四种四种dNTPdNTP浓度度应相等相等; ; PCR PCR常用的常用的浓度度为50-200μM50-200μM，不能低于，不能低于10-10-15μM15μM 浓度度过高会抑制高会抑制Taq Taq 酶的活性，易的活性，易产生生错误碱基的碱基的 掺入，入，浓度度过低那么降低反响低那么降低反响产量量5〕〕10×PCR缓冲液冲液 (Mg2+)：： 500 mM KCl，， 100 mM Tris-HCl (pH 8.4)，， 150 mM MgCl2 ，， 1 mg/ml明胶PCR反响体系：反响体系： 10×PCR buffer 2.5μl dNTP mix 各各0.5μl 引物引物1 0.5 μl 引物引物2 0.5 μl DNA模板模板 2 μl Taq 酶 0.5 μl 加双蒸水至加双蒸水至总体体积为25μlPCR扩增程序扩增程序: 94℃, 300S 94℃, 60S 55℃, 60S 72℃, 60S 72℃, 7min 30 循环2. 电泳技术电泳技术电泳槽电泳槽制胶板制胶板梳子梳子电源电源电泳仪电泳仪提提供供稳定定的的电压或或电流流电极极缓冲冲液液和和凝凝胶胶的的容容器器构构成成点点样孔孔制制备垂垂直直或或程程度度凝凝胶胶电泳分别的原理电泳分别的原理 电泳电泳(electrophoresis)(electrophoresis)溶液中带电粒子溶液中带电粒子( (离子离子) )在电场中挪动的景象。

在电场中挪动的景象 1 1、电荷效应、电荷效应 利用带电粒子在电场中挪动速度不同而到达分别的目的利用带电粒子在电场中挪动速度不同而到达分别的目的 2 2、分子筛效应、分子筛效应 不同的分别介质构成的孔径不同，在孔径大的介质中泳动速度快，相反那么不同的分别介质构成的孔径不同，在孔径大的介质中泳动速度快，相反那么慢 3 3、待分别生物大分子的性质、待分别生物大分子的性质 普通来说，分子带的电荷量越大、直径越小、外形越接近球形，那么其电普通来说，分子带的电荷量越大、直径越小、外形越接近球形，那么其电泳迁移速度越快泳迁移速度越快 4 4、电场强度、电场强度 电场强度〔电场强度〔V/cmV/cm〕是每厘米的电位降，也称电位梯度电场强度越大，电〕是每厘米的电位降，也称电位梯度电场强度越大，电泳速度越快泳速度越快电泳技术的种类电泳技术的种类 按支持介按支持介质的不同可分的不同可分为：： ⑴⑴ 纸电泳泳(Paper electrophorisis) ⑵⑵ 醋酸醋酸纤维薄膜薄膜电泳泳(Cellulose Acetate electrophoresis) ⑶⑶ 琼脂凝胶脂凝胶电泳泳(Agar Gel electrophoresis) ⑷⑷ 聚丙聚丙烯酰胺凝胶胺凝胶电泳泳(Polyacrylamide Gel electrophoresis) (PAGE) ⑸⑸ SDS－聚丙－聚丙烯酰胺凝胶胺凝胶电泳泳(SDS－－PAGE)。

琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳对于双链对于双链DNA，电泳迁移率的大小主要与，电泳迁移率的大小主要与DNA分子大小有关分子大小有关 1、熔化琼脂糖时，宜低火，防暴沸；2、倒胶时温度要低于60℃且速度要慢；3、拔梳子和点样要小心，以免破坏胶孔；4、电泳仪翻开前应检查电压、电流旋纽能否处于零位置，任务电压普通为60-80V，400mA，电泳终了应将电压、电流旋钮恢复到零位置；5、防止EB污染和紫外灯伤眼本卷须知：琼脂糖浓度〔％〕琼脂糖浓度〔％〕DNA有效分别范围〔有效分别范围〔Kb〕〕0.530～～10.712～～0.81.010～～0.51.27～～0.41.53～～0.2不同浓度大小琼脂糖的有效分别范围不同浓度大小琼脂糖的有效分别范围 M P 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 CK M P 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 CK。