蛋白质棕榈酰化修饰的分析方法进展.doc

精选财经经济类资料---------------------------------------------- -----------------------------------------------最新财经经济资料----------------感谢阅读-----------------------------------~ 1 ~蛋白质棕榈酰化修饰的分析方法进展摘要：棕榈酰化修饰是蛋白质翻 译后脂质修饰的重要形式之一，在细胞 信号传导、代谢、凋亡、疾病的发生、 发展等过程中都起着重要的作用因此， 定性和定量分析蛋白质棕榈酰化修饰对 理解其生物学功能具有重要意义本文 综述了近年出现的蛋白质棕榈酰化修饰 分析技术和方法及其优缺点，并对其未 来的发展趋势进行了展望 中国论文网 /8/view-12767101.htm关键词：棕榈酰化修饰； 质谱 技术； 蛋白质组学； 评述 1 引言 蛋白质翻译后修饰的发生使得蛋-------------------------------------------------------精选财经经济类资料---------------------------------------------- -----------------------------------------------最新财经经济资料----------------感谢阅读-----------------------------------~ 2 ~白质的结构更复杂、功能更完善，在生 物体内起着极为重要的作用，脂类修饰 便是其中一种非常重要的翻译后修饰形 式。

棕榈酸盐是丰度最高的脂肪酸，可 被共价修饰到蛋白质上根据连接方式 不同，棕榈酰化修饰可分为 N 型（通过 酰胺键连接到 Gly/Cys 残基上）和 S 型 蛋白质的 S 型棕榈酰化修饰 （Palmitoylation）是指饱和的 16 个碳 的棕榈酸盐通过硫酯键共价修饰到蛋白 质 Cys 的巯基上[1]，如图 1 所示） ，它 是一种动态、可逆的翻译后修饰形式， 可在时间和空间上调节蛋白质的功能 许多棕榈酰化修饰的可溶或整合膜蛋白 质，如信号蛋白质（包括在癌症和突触 信号中断关键因子） 、细胞黏附分子和 神经递质受体等，可调控蛋白质的活性 和稳定性，蛋白蛋白相互作用，促进蛋 白质定位膜脂筏等，在细胞信号传导、 代谢、凋亡、疾病的发生和癌变中都起 着重要的作用[1，2] 深入研究和理解蛋白质棕榈酰化-------------------------------------------------------精选财经经济类资料---------------------------------------------- -----------------------------------------------最新财经经济资料----------------感谢阅读-----------------------------------~ 3 ~修饰的机制，定性和定量分析含这种修 饰的蛋白质，以及对棕榈酰化和去棕榈 酰化修饰相关酶的理解、动态监控棕榈 酰化和去棕榈酰化的周期，对理解复杂 信号通路的空间和时间调节等都具有重 要意义。

定点突变法是传统的方法一 般是将候选的半胱氨酸 Cys 残基突变为 Ser 或 Ala，将突变体克隆和野生型分别 转染细胞，并比较两者的功能差异但 这种方法不能直接检测内源蛋白质，棕 榈酰化修饰位点的突变可能会导致附近 的 Cys 残基发生异常[3]此外，许多蛋 白质棕榈酰化抑制剂及去棕榈酰化的棕 榈酰硫脂酶也被广泛使用，例如，2 溴 软脂酸乙烯（2Bromopalmitate， 2BP） [4]，浅蓝菌素（Cerulenin）和衣霉素 （Tunicamycin）等都具有较好的效果[5] 尽管这些方法的应用促进了人们对蛋白 质棕酰化修饰的认识，但在没有任何修 饰位点信息提示的情况下，这样的研究 过程不但耗时费力，而且棕榈酰化修饰 位点的鉴定比较困难这是因为：-------------------------------------------------------精选财经经济类资料---------------------------------------------- -----------------------------------------------最新财经经济资料----------------感谢阅读-----------------------------------~ 4 ~（1）虽然已知一些蛋白质酰基转移酶 在富含半胱氨酸的结构域中有保守的 DHHC motif，且也已发现几种去酰化酶， 但蛋白质发生 S 棕榈酰化修饰和去棕榈 酰化修饰的酶学尚不清楚[6]；（2）还 没有明确的蛋白质棕榈酰化修饰的共识 基序（Consensus motif）[7]；（3）棕 榈酰化修饰通常发生在跨膜蛋白或膜相 关的蛋白质[8]，而膜蛋白的溶解度和丰 度低，长链脂肪酸的加入更进一步增加 了其疏水性，增加了检测难度；（4） 不像磷酸化和糖基化修饰，它没有亲和 基团如棕榈酰化修饰特异的抗体等用于 富集低丰度的棕榈酰化修饰蛋白质。

因 此，人们对它的认识远不及糖基化、磷 酸化等其它翻译后修饰 目前，随着质谱和组学技术的发 展，越来越多的棕榈酰化修饰蛋白质及 其修饰位点得到了鉴定，极大地促进了 人们对蛋白质棕榈酰化修饰的理解为 此，本文就基于质谱和组学手段的棕榈 酰化修饰蛋白质/肽段的分析方法及其进-------------------------------------------------------精选财经经济类资料---------------------------------------------- -----------------------------------------------最新财经经济资料----------------感谢阅读-----------------------------------~ 5 ~展进行了综述 2 生物信息学预测方法 3 质谱法直接检测蛋白质的棕榈 酰化修饰位点和脂质基团 质谱分析具有灵敏度高、样品用 量少等优点，能准确分析连接到酰化修 饰蛋白质甚至是单一酰化修饰位点上的 脂肪酸种类一般是通过层析或免疫沉 淀等方法获得目标蛋白质，根据序列的 特性选择合适的酶进行蛋白质酶解后， 然后比较羟胺处理前后相应酶解肽段的 质量会发生变化，从而可通过质谱方法 鉴定该酰化修饰基团的分子特性[14]。

Hemagglutinin（HA）是一个主要的包 膜糖蛋白调节病毒和细胞膜融合，通过 含有一个跨膜域和一个胞质尾的轻 HA2 链锚定在病毒包膜上，C 末端区域的 3 个 Cys 残基（一个在跨膜域，两个在胞 质尾）是高度保守，且在所有 HA 亚型 中都可能棕榈酰化Kordyukova 等[15] 用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱 （MALDITOF MS）分析流感病毒蛋白-------------------------------------------------------精选财经经济类资料---------------------------------------------- -----------------------------------------------最新财经经济资料----------------感谢阅读-----------------------------------~ 6 ~HA 上脂肪酸的类型时发现，具有两个 胞质 Cys 的 Influenza B virus HA 含有棕 榈酰化修饰，具有一个跨膜 Cys 的 Influenza C virus HA 发生了硬脂酸酰化 修饰，而有一个跨膜和两个胞质 Cys 的 Influenza A virus HA 则同时包含棕榈 酸盐和硬脂酸酰化修饰。

Serebryakova 等[16]用 MALDITOF MS 分析 A/X31（H3 subtype） ，A/Puerto Rico/8/34 （H1 subtype）和 A/FPV/Weybridge/34 （H7 subtype）病 毒中 C 末端 HA2 肽段时，发现这些肽 段不仅能被棕榈酸盐修饰，还能被硬脂 酸修饰，且 3 株病毒中棕榈酸/硬脂酸的 比例不同，其中 A/FPV/Weybridge/34 病毒株优先结合硬脂酸Ozols 等[17]用 溴化氰裂解、Trysin 和 LysC 酶解纯化 的含[3H]palmitate 标记的 αTubulin 后进 行质谱分析发现，与 C20， C213 和 C305 相比，C376 是主要的棕榈酰化修 饰位点Bizzozero 等[18]发现棕榈酰化 是天然髓鞘蛋白脂质蛋白（PLP）的主-------------------------------------------------------精选财经经济类资料---------------------------------------------- -----------------------------------------------最新财经经济资料----------------感谢阅读-----------------------------------~ 7 ~要翻译后修饰类型，且在中枢神经系统 中大多数的 PLP 和 DM20 是完全酰化 的。

气相色谱质谱联用（GCMS）被 广泛用于复杂组分的分离与鉴定，其具 有 GC 的高分辨率和 MS 的高灵敏度， 适于低分子化合物尤其是挥发性成分的 分析Sorek 等用 GCMS 分析了蛋白质 AtROP6[19]和 CBL1[20]上的脂质基团； 在氧化铂（Ⅳ）存在下，通过氢化反应 将 S 棕榈酰化修饰蛋白质的巯酯键打断， 释放蛋白质上的脂肪酸基团并用纯甲酸 和乙醇产生乙基酯化后，用 GCMS 分 析了蛋白质的 S 棕榈酰化修饰，该法能 分析低至 1 μg 的纯化蛋白质，并可实现 S 棕榈酰化水平的相对定量[21]，他们 认为，通过氢化反应并结合乙基酯化可 得到极性基团的脂肪酸，提高 GC 的分 离和鉴定体外转移甲基和稳定同位素 标记法（iFAT）结合 GCMS 方法可定 量比较不同细胞状态下的酰基修饰[22]， iFAT 法适于处理疏水性的膜蛋白质，-------------------------------------------------------精选财经经济类资料---------------------------------------------- -----------------------------------------------最新财经经济资料----------------感谢阅读-----------------------------------~ 8 ~通过数据库检索和标准脂肪酸甲酯的色 谱保留时间可实现酰基的鉴定，稳定同 位素标记可用作内标准确比较不同细胞 状态下酰基修饰。

但许多棕榈 酰化修饰的蛋白质是膜蛋白，疏水性较 强，不容易得到纯化的蛋白质样品，这 在一定程度上限制该方法的应用 4 以“棕榈酸盐为中心”的分析方 法 4.1 放射性棕榈酸盐代谢标记法 最经典的方法是用放射性棕榈酸 盐（例如，3Hpalmitate 和 125Ipalmitate）代谢标记培养细胞，通 过放射自显影检测同位素标记的程度， 检测棕。