微生物实验教案.docx

名师归纳总结 精品word资料 - - - - - - - - - - - - - - -学习好资料 欢迎下载试验 1 培育基的配制一、试验目的和内容目的：学习和把握配制培育基的一般方法和步骤；内容： 1．牛肉膏蛋白陈培育基的配制；2．高氏 1 号培育基的配制；3．马丁氏培育基的配制；二、试验材料和用具牛肉膏、 蛋白胨、 琼脂、可溶性淀粉、 葡萄糖、 孟加拉红、 链霉素、 1mol/L NaOH 、lmol/LHCl 、KNO 3、NaCl 、K 2HPO 4· 3H2O、MgSO 4· 7H 2O、FeSO4· 7H 2O；试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、天平、牛角匙、 pH 试纸、棉花、牛皮纸、记号笔、线绳、纱布、漏斗、漏斗架、胶管、止水夹等；三、操作步骤（一）牛肉膏蛋白胨培育基的配制牛肉膏蛋白胨培育基是一种应用最广泛和最一般的细菌基础培育基；其配方如下： 牛肉膏 3g，蛋白胨 10g，Nacl5g ，琼脂 15～ 20g，水 1000mL ， PH7.4～ 7.61．称药品 按实际用量运算后， 按配方称取各种药品放入大烧杯中； 牛肉膏可放在小烧杯或表面皿中称量， 用热水溶解后倒入大烧杯； 也可放在称量纸上称量， 随后放入热水中，牛肉膏使与称量纸分别，立刻取出纸片；蛋白胨极易吸潮，故称量时要快速；2．加热溶解 在烧杯中加入少于所需要的水量，然后放在石棉网上，小火加热，并用玻棒搅拌， 待药品完全溶解后再补充水分至所需量； 如配制固体培育基， 就将称好的琼脂放入己溶解的药品中，再加热融解，此过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，最终补足所失的水分；3． 调 pH 检测培育基的 pH ，如 pH 偏酸，可滴加 lmol/L NaOH ，边加边搅拌，并随时用 pH 试纸检测，直至达到所需 pH 范畴； 如偏碱， 就用 lmol/L HCl 进行调剂； pH 的调剂通常放在加琼脂之前；应留意 pH 值不要调过头，以免回调而影响培育基内各离子的浓度；4．过滤 液体培育基可用滤纸过滤， 固体培育基可用 4 层纱布趁热过滤， 以利培育的观看；但是供一般使用的培育基，这步可省略；5．分装 按试验要求， 可将配制的培育基分装入试管或三角瓶内； 分装时可用漏斗以免使培育基沾在管口或瓶口上而造成污染；分装量：固体培育基约为试管高度的 l/5 ，灭菌后制成斜面；分装入三角瓶内以不超过其容积的一半为宜；半固体培育基以试管高度的 1/3 为宜，灭菌后垂直待凝；6．加棉塞 试管口和三角瓶口塞上用一般棉花 〔非脱脂棉 〕制作的棉塞；棉塞的外形、大小和松紧度要合适， 四周紧贴管壁， 不留缝隙， 才能起到防止杂菌侵入和有利通气的作用；要使棉塞总长约 3/5 塞入试管口或瓶口内，以防棉塞脱落；有些微生物需要更好的通气，就可用 8 层纱布制成通气塞；有时也可用试管帽或塑料塞代替棉塞；7．包扎 加塞后， 将三角瓶的棉塞外包一层牛皮纸或双层报纸， 以防灭菌时冷凝水沾湿棉塞；如培育基分装于试管中，就应以 5 支或 7 支在一起， 再于棉塞外包一层牛皮纸，用绳扎好；然后用记号笔注明、培育基名称、组别、日期；8．灭菌 将上述培育基于 121.3℃湿热灭菌 20min；如因特殊情形不能准时灭菌，就 应故交冰箱内暂存；9．摆斜面 灭菌后， 如制斜面， 就需趁热将试管口端搁在一根长木条上，并调整斜度，便斜面的长度不超过试管总长的 1/2； 第 1 页，共 19 页 - - - - - - - - -名师归纳总结 精品word资料 - - - - - - - - - - - - - - -学习好资料 欢迎下载10．无菌检查 将灭菌的培育基放入 37℃温箱中培育 24～ 48h，无菌生长即可使用，或贮存于冰箱或清洁的橱内，备用；（二）高氏 l 号培育基的配制高氏 1 号培育基是用于分别和培育放线菌的合成培育基；其配方如下：可溶性淀粉 20g， KNO 3 1g， NaCl 0.5g，K 2HPO 4·3H 2O 0.5g， MgSO 4· 7H 2O 0.5g ， FeSO4· 7H 2O 0.01g ，琼脂 15～ 20g，水 1000mL ， pH7.4 ～ 7.6；l．称量和溶解 先运算后称量，按用量先称取可溶性淀粉，放入小烧杯中，并用少量冷水将其调成糊状，再加至少于所需水量的水，连续加热，边加热边搅拌，至其完全溶解；再加入其他成分依次溶解；对微量成分 FeSO4· 7H 2O 可先配成高浓度的贮备液后再加入， 方法是先在 1000mL 中加入 1g 的 FeSO4·7H 2O，配成浓度为 0.01g/mL 的贮备液，再在 1000mL培育基中加入以上贮备液 1mL 即可；待全部药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积；如要配制固体培育基，其琼脂溶解过程同牛肉膏蛋白胨培育基配制；2． pH 调剂、分装、包扎及无菌检查 同牛肉膏蛋白胨培育基配制；（三）马丁氏培育基的配制马丁氏培育基是用于分别真菌的挑选培育基；其配方如下：K2HPO 4 1g， MgSO 4· 7H2O 0.5g，蛋白胨 5g，葡萄糖 l0g ，琼脂 15～20g，水 1000mL ，自然 pH；1．称量和溶解 先运算后称量，按用量称取各成分，并将其溶解在少于所需的水中；待各成分完全溶解后，补充水分到所需体积；再将孟加拉红配成 1% 的水溶液，在 1000mL培育液中加入以上孟加拉红溶液 3.3mL ，混匀后，加入琼脂加热融解，方法同牛肉膏蛋白胨培育基配制；2．分装、包扎、灭菌及无菌检查同牛肉膏蛋白膝培育基配制；3．链霉素的加入 链霉素受热简洁分解， 所以临用时， 将培育基融解后待温度降至 45℃ 左右时才能加入；可先将链霉素配成 1%的溶液 〔配好的链霉素溶液储存于 -20℃ 〕，在 100mL 培育基中加 1% 链霉素 0.3mL ，使每毫升培育基中合链霉素 30μ g；四、留意事项称药品用的牛角匙不要混用，称完药品应准时盖紧瓶盖；调 pH 时要当心操作，防止回调；不同培育基各有配制特点，要留意具体操作；五、试验报告记录本试验配制培育基的名称、数量，并图解说明其配制过程，指明要点；六、问题和摸索l．配制培育基有哪几个步骤 .在操作过程中应留意些什么问题 .为什么 . 2．培育基配制完成后，为什么必需立刻灭菌 .如不能准时灭菌应如何处理 .已灭菌的培养基如何进行无菌检查 .3．试设计试验对饮料进行无菌检查；试验 2 高压蒸汽灭菌一 目的要求1．明白高压蒸汽灭菌的基本原理及应用范畴；2．学习高压蒸汽灭菌的操作方法；二 基本原理高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内， 通过加热， 使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽； 待水蒸汽急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽， 然后关闭排气 第 2 页，共 19 页 - - - - - - - - -名师归纳总结 精品word资料 - - - - - - - - - - - - - - -学习好资料 欢迎下载阀，连续加热，此时由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌锅内的压力，从而使沸点增高，得到高于 100℃的温度；导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的；在同一温度下， 湿热的杀菌效力比干热大； 其缘由有三： 一是湿热中细菌菌体吸取水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低（表 2— 1），二是湿热的穿透力比干热大（表 2— 2），三是湿热的蒸汽有潜热存在； 1g 水在 100℃时，由气态变为液态时可放出 2.26kJ〔千焦 〕的热量；这种潜热，能快速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力；卵白蛋白含水量表 2— 1/%蛋白质含水量与凝固所需温度的关系30 分钟内凝固所需温度 /℃50562574～ 801880～ 9061450160～ 170在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时， 灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要， 由于空气的 膨胀压大于水蒸汽的膨胀压，所以， 当水蒸汽中含有空气时， 在同一压力下，含空气蒸汽的 温度低于饱和蒸汽的温度；灭菌锅内留有不同重量空气时，压力与温度的关系见（表 2— 3）表 2-2 干热温热穿透力及灭菌成效比较温度 /℃时间 /h透过布层的温度/℃灭菌干热420 层8610 层72100 层70.5不完全130-140湿热 105.33101101101完全表 2—3 灭菌锅留有不同重量空气时，压力与温度的关系压力数全部空气2/3 空气1/2 空气1/3 空气空气全不MpaKg/cm 2Ib/in 2排出时的温度 /℃排出时的温度 / ℃排出时的温度 /℃排出时的温度 /℃排出时的温度 /℃0.030.355108.81009490720.070.7010115.6109105100900.1010.515121.31151121091000.141.4020126.21211181151090.171.7525130.01261241211150.212.1030134.6130128126121现在法定压力单位己不用磅和 kg/cm 2 表示，而是用 Pa 或 bar 表示，其换算关系为：1kg/cm 2=98066.5Pa； 1Ib/in 2=6894.76Pa.一般培育基用 0.1Mpa （相当于 15 Ib/in 2 或 1.05kg/cm 2）， 121.5℃ ,15 ～30min 可达到完全灭菌的目的；灭菌的温度及维护的时间随灭菌物品的性质和容量等具体情形而有所转变；2 2例如含糖培育基用 0.06Mpa（ 8Ib/in 或 0.59kg/cm ）112.6 ℃灭菌，然后以无菌操作手续加入灭菌的糖溶液；又如盛于试管内的培育基以 0.1Mpa,121.5 ℃灭菌 20min 即可，而盛于大瓶内的培育基最好以 0.1Mpa，122℃灭菌 30min；试验中常用的非自控高压蒸汽灭菌锅有卧式（图 2-2 ， A）和手提式（图 2— 2，B）二种，其结构和工作原理相同，本试验以手提式高压蒸汽灭菌锅为例，介绍其使用方法， 有关自控高压蒸汽灭菌锅（ autoclave ）的使用可参照厂家说明书； 第 3 页，共 19 页 - - - - - - - - -名师归纳总结 精品word资料 - - - - - - - - - - - - - - -学习好资料 欢迎下载三 器材牛肉膏蛋白胨培育基，培育皿 〔6 套一包 〕 ，手提式高压蒸汽灭菌锅等；四 操作步骤1．第一将内层锅取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜； 切勿遗忘加水，同时水量不行过少，以防灭菌锅烧干而引起炸裂事故；2．放回内层锅，并装入待灭菌物。