石蜡制片方法-1幻灯片.ppt

固定液的种类和常用固定液的配方固定液的种类分为两大类：简单固定液和混合固定液 1.简单固定液又称单纯固定液 就是用一种化学试剂作为固定液种类有：乙醇、福尔马林、醋酸、苦味酸、铬酸、重铬酸钾、升汞和锇酸等八种 2.混合固定液 就是用几种化学药品，按一定的比例混合配制而成的，由于各种药品的优缺点互相弥补，因此可产生较好的效果常用固定液的配方 （1）福尔马林[Formalin，37—40％的甲醛(HCHO)] 适合固定的浓度：10％福尔马林(3.7—4％甲醛) （2）卡诺氏液(Carnoy's Fluid) 适用范围：适用于胚胎学、细胞学研究 配方： (1) 纯酒精 3份 冰醋酸 1份 (2) 纯酒精 6份 冰醋酸 1份 氯 仿 3份,卡诺氏液的处理方法和特点 处理：固定时间为12—24小时，有的也可缩短.例如根尖可固定15分钟，花药固定1小时，子房可固定12—24小时固定完毕可用95％或纯酒精洗涤，换二次，经二甲苯与纯酒精等量混合液过渡，二甲苯透明两次，就可进入石蜡中浸蜡。

如果不立即制片时，可转入70%酒精中保存 特点：这两种固定液穿透力既强又快，纯酒精固定细胞质，冰醋酸固定染色质，并能防止组织由酒精引起的高度收缩与硬化3）福尔马林——醋酸——酒精混合液(FAA) 适用范围：适用于除单细胞及丝状藻类以外的植物组织，但不适于作细胞学研究 配方： 50％或70％酒精 90毫升 冰醋酸 5毫升 福尔马林 5毫升 处理：(1)一般柔软材料，特别是苔藓植物，可用低度(50％)酒精2)固定时间最短需18小时，也可无限期延长，木质小枝至少须固定一周.(3)冲洗时材料可直接换入50％或70％酒精中洗一、二次，木质材料在流水中冲洗48小时，并在酒精(50％)和甘油溶液(1：1)中浸2、3天，使它软化4）纳瓦兴氏液(Navaschin’s Fluid) 适用范围：植物组织及细胞学的研究 配方： 甲液： 10％铬酸 15毫升 冰醋酸 10毫升 蒸馏水 75毫升 乙液： 福尔马林 40毫升 蒸馏水 60毫升 在使用之前，才将甲、乙两液等量混合。

材料经固定之后可在此液中长期保存 处理：固定时间为24-48小时，固定后可直接在蒸馏水中洗几次，再继续脱水冲洗目的 材料自固定液中取出后，须立即冲洗，使其中含有的固定液全部除去，—直到洗净为止，否则防碍染色和保存冲洗液的选择冲洗液应依固定液的性质而定，一般水溶性的固定剂用水来冲洗，酒精溶性的固定剂用相同浓度的酒精冲洗冲洗的方法水冲洗法 酒精洗涤法,脱水脱水的目的 使组织中的水分完全除去，并使组织变硬各种材料经固定与冲洗后，组织中就含有大量水分，不能直接投入石蜡中包埋因为水和石蜡是不能溶合的，一定要经过脱水剂将水分脱净，透明剂透明后，才能进入包埋阶段如脱水不干净，就会影响制片效果，甚至完全失败 脱水剂及其脱水方法 脱水剂 最常用的脱水剂为酒精此外还有丙酮、正丁醇和叔丁醇等脱水方法 1.配制下列各级浓度的酒精： 15％，35％，50％，70％，85％，95％，100％ 2.一般经水洗的材料，脱水可自35％开始，柔弱的材料自15％开始，若用酒精洗涤，则可直接移入50％或70％酒精中继续脱水 3.在每级度中停留的时间，依材料的大小、性质以及留在固定液中的时间长短和固定液的溶解性而定。

一股的标准是： (1)如洋葱、蚕豆等根尖和小片叶子一样大小的材料，每级停留约30分钟到1小时若用苦味酸固定则可延长为1小时2)由FAA固定的草本茎，每级停留2小时，木本茎停4小时，较大的木材每级应延长为8—12小时 (3)脱水至纯酒精时，需更换二次，每次30分钟到1小时；材料大者，可多换一次由95％换100％酒精时，瓶子上的塞子也应更换干燥的，以免有水分渗入 (4)已制成的切片，在染色缸中脱水时，每级停留时间约为3—10分钟 (5)脱水时应按顺序进行，级度不宜相差太大，一般应按第1项所配各级浓度进行透明透明的目的 透明的主要目的：使组织中的酒精或丙酮被透明剂所替代，使石蜡能很顺利的进入组织中，或增强组织的折光系数，并能和封藏剂混合进行封藏透明剂的特性 作为透明剂必须具有既能与脱水剂相溶又能与包埋剂相溶的特性透明剂的种类 常用的明透剂有二甲苯、甲苯、苯、氯仿、香柏油和苯胺油等，二甲苯为最常用的透明剂透明的方法 为了避免组织收缩，在纯酒精或丙酮脱水以后，并不直接移入二甲苯中，其间必须经过几个级度，逐渐置换酒精与二甲苯混合的比例列表如下：,在透明时应注意的问题 如脱水不净，用二甲苯透明后，将发生下列不良后果： 1.如材料内仍留有微量水分，二甲苯就进不去，因此石蜡也不能透入，切片后将在蜡片上出现空洞，影响结果。

2.切片内留有微量水分，在封藏以后，就会发生乳白色的云雾状，在显微镜下观察时，可见许多密集水珠把组织掩盖，影响观察 3.二甲苯极易挥发，故在切片透明之后，从染色缸中取出封藏，手续要敏捷，不宜久置，否则待二甲苯挥发干净后，组织就变硬发白4.二甲苯极易吸收空气中的水分，故在湿度大的天气，贮有二甲苯的染色缸的盖子周缘可涂少许凡士林，以防止水分的渗入在封片时也不宜将口鼻过分靠近切片，以免水气侵入，出现白色云雾状 5.二甲苯必须保持无水、无酸若用一、二滴石蜡油滴入其中，立即出现云雾状，即表示其中已含有水分，不能再用浸蜡 将石蜡浸入整个组织的过程称为浸蜡包埋剂 包埋所用的各种石蜡，其熔点约在50-60℃之间 石蜡的选择方法 1.依所包埋的材料不同而异，软的材料用软石蜡，硬的材料用硬石蜡一般动物材料最常用的石蜡熔点为52-56℃，植物材料用的石蜡熔点为54-58℃ 2.如果需要切很薄的片子(4微米以下)，可用熔点58-60℃的石蜡，较厚的则用熔点52-54℃的 3.根据当地当时的气候条件，夏天气温高时，通常用56-58℃的蜡，冬天气温低时用54-56℃的蜡石蜡,性质好的石蜡，必须具备的条件 (1)熔点已知。

(2)结构细致，光滑而均匀 (3)无灰尘、水分及挥发性物质等鉴定石蜡品质优劣的方法 可先将石蜡熔化，倒入纸匣中凝成蜡块，如品质优良，则具备下列特点： (1)无气泡，无不透明的点子和裂痕 (2)蜡块断裂后，其断裂面不呈颗粒状 (3)如果将它切成薄片，不会碎成细粒石蜡的清净方法 1.将石蜡放入锅中加热到开始冒白烟后为止，使其中的水分及挥发性杂质逐渐被蒸发掉 2.热过的石蜡放在温暖处慢慢冷却，这样就可使其中的灰尘等杂质颗粒沉下去 3.待石蜡的表面已凝为固体时，即可慢慢地将上面的石蜡倒在纸匣或其它容器中，把下面沉淀的杂质留下来 也可在温箱中熔化和过滤浸蜡方法浸蜡方法(1)将组织留在透明剂(如二甲苯)中，在这种冷的透明剂(亦为石蜡溶剂)上轻轻倒上一层已熔化的石蜡，其分量比例约为3：2 (2) 倒入的石蜡即凝成固体，然后将材料放在35-37℃之间的熔蜡炉内，经一、二天到石蜡不再继续熔化时为止 (3) 将材料移入56-60℃的恒温箱中停留2—5小时，待石蜡融化后换纯蜡 (4)换二、三次新鲜纯石蜡，使留在组织内的透明剂全部排除后即可包埋浸蜡过程应注意的问题 1.尽量保持在较低温度中，以石蜡不凝固为度。

2.力求在最短时间内完成石蜡的浸透过程因为温度过高或时间过长都会引起组织变硬、变脆、收缩等，影响制片效果包埋 所谓包埋就是被石蜡所浸透的组织连同熔化的石蜡，一起倒入一定形状的容器(如纸盒)内，并立即投入冷水中，使它立刻凝固成蜡块的过程包埋的操作过程(一)将组织块进入第3次纯蜡之后，必须做好下列准备工作 1.将展片台及酒精灯取出，放在熔蜡炉或恒温箱旁 2.摺包埋用的纸盒并写好标签 3.检查恒温箱中所熔的新鲜石蜡是否够用纸合的折叠方法,(二)在组织块已充分浸蜡后，即可进行下列工作： 1.在脸盆或水槽内放入冷水备用 2.打开展片台电源开关，调节温度至40℃，点燃酒精灯，准备好1把镊子，1支拨针 3.将纸盒放在展片台上 (三)右手持镊子，左手从恒温箱中取出盛满熔化石蜡的小瓶，并随手将恒温箱的门关闭，立即将小瓶中的石蜡和材料一起倒入包埋用的纸盒中，如果纸盒中蜡的量少，可再加入适量的蜡 (四)材料倒入纸盒后，将镊子在酒精灯上烧热，根据切片的要求，将材料放到适当的位置，材料之间要保持一定的距离，并注意材料的方向五)将拨针烧热，沿着纸盒的边缘以及材料的周围轻轻移动，目的是将蜡中的气泡赶走和使蜡凝固时较均匀。

六）将标签插入纸盒的边缘，并将有字的一端露在外面 (七)轻轻将纸盒两侧的把手提起，慢慢地平放在脸盆或水槽中的水面上，待纸盒内石蜡的表面已凝固，即可将纸盒向一侧倾斜，使冷水从一边侵入纸盒，并立即使它沉入水中，使盒中包埋块迅速冷却 （八）纸盒在水中经30分钟到1小时后即可取出，将纸盒打开取出包埋的蜡块，即可贮藏备用包埋子房时，子房方向的确定：,胚珠纵切,包埋中出现的问题及其解决办法问题 包埋后的石蜡块应为均匀的半透明状态，但有时出现白色混浊的结晶部分，这样在切片时就有妨碍原因 1.脱水不干净2.组织内部或石蜡中混有透明剂3.石蜡本身品质不良4.纸盒中周围的石蜡先成凝固状态，中部的石蜡凝固较晚5.石蜡冷凝得太慢解决办法 属于前三个原因者，应在包埋之前就须注意属于后二个原因者，应将包埋块再投入纯蜡中熔化后重新包埋切片蜡块的分割、整修与固着1.选取所要切片的材料，用单面刀片从包埋的石蜡块上切割下来，注意不可损伤所包埋的组织2.确定切面的方位，用刀片将石蜡的四面作初步的整修3.取一块台木，用镊子夹取少量的碎蜡放于台木上，后点燃酒精灯，烧热镊子将台木上的石蜡熔化，迅速将蜡块粘在台木上4.再用镊子夹取少许碎蜡放在蜡块四周，后在酒精灯上将镊子烧热，迅速将蜡块四周的碎蜡熔化烫平，使石蜡块牢固地粘在台木上。

蜡块切修,将蜡块粘在台木上,整修蜡块时，应注意的问题 1.应将蜡块的前后、左右四个面，两两修成平行的面，这样切成的蜡带就成直线，如果两面不平行，切成的蜡带将弯曲 2.将蜡块四周多余的蜡修掉，但注意不要太靠近组织，特别是不要将组织露在外面切片切片的主要步骤如下： 1.将粘有蜡块的台木装在切片机的装物部位上 2.装刀以前必须检查刀口是否锋利，如刀上有缺口或太钝，均会使材料破裂，这样必须磨刀，以免浪费材料 3.将切片刀装在夹刀部上，调整刀片的角度，一般以5—8℃为宜 4.蜡块切取面和刀口必须平行，并且使刀口恰好邻近蜡面，切忌蜡块超过刀口 5.一般石蜡切片以5—10微米厚度最为适宜，在调节厚度时，必须对准刻度，决不能调在两个刻度之间，否则不仅会损坏机器，同时也影响切片厚度的不均6.上述各点在调节好后，即可进行切片，用力要均匀，速度要适宜开始时被切的片子往往不完整，这是由于蜡块的面不平整所致，待切数片后，就能得到完整的蜡带，到蜡带长度达到20-30cm时，即可用毛笔挑起安放于盘中的白纸上，按顺序排好，便于以后检查 当机器转动时，蜡块向前推进，切到一定的时候，推进会终止，此时应拉动齿轮的长臂使与齿分离，然后摇动齿轮退回原处，并将切刀移近蜡块，才能继续切片。