蛋白质的测定.docx

蛋白质的化学反应及与食品成分的相互作用1 蛋白质与水的相互作用：蛋白质的水溶性蛋白质与水之间的作用力主要是蛋白质中的肽键（偶极-偶极相互作用或氢键），或氨基酸的侧链（解离的、极性甚至非极性基团）同水分子之间发生了相互作用影响蛋白质水溶性的应素很多：（1）pH>pI 时，蛋白质带负电荷，pH=pI 时，蛋白质不带电荷，pH 时，蛋白质带正电荷溶液的 pH 低于或高于蛋白质的 pI 都有利于蛋白质水溶性的增加，一方面是加强了蛋白质与水分子的相互作用，另一方面蛋白质链之间的相互排斥作用等电沉淀2）离子强度：μ=0.5ΣCiZi2，Ci 表示离子强度，Zi 表示离子价数盐溶：当溶液中的中性盐浓度在 0.5mol/L 时，可增加蛋白质的溶解性，盐作用减弱蛋白质分子之间的相互作用盐析：当溶液中的中性盐的浓度大于 1mol/L 时，蛋白质会沉淀析出，这是盐与蛋白质竞争水分的结果不同盐类对蛋白质的盐析作用强弱不同将这种强弱顺序称为感胶离子序：（3）非水溶剂：有些有机溶剂可引起蛋白质变性沉淀，主要是有机溶剂降低了水的介电常数，蛋白质之间的静电斥力降低4）温度：温度低于 40-50℃时，随温度的增大水溶性增大，当温度大于 50℃，随温度的增大，水溶性降低。

根据蛋白质的溶解性对蛋白质分类：（1）清蛋白：可溶于 pH6.6 的水中，血清清蛋白，卵清蛋白，α-乳清蛋白；（2）球蛋白：能溶于 pH7 的稀碱溶液，β-乳球蛋白；（3）醇溶蛋白：能溶于 70%的乙醇，玉米醇溶蛋白；（4）谷蛋白：在上述溶剂中都不溶解，但可溶于酸（pH2）或碱（pH12）2 织构化在许多食品体系中，蛋白质是构成食品结构和质地的基础，无论是生物组织（鱼和肉的肌原纤维蛋白），还是配制食品（如面团、香肠、肉糜等）还可以通过织构化加工植物蛋白使其具有咀嚼性及持水性的纤维状产品一般蛋白质织构化的方法有：（1）热凝固和薄膜形成：豆浆在 95℃保持几小时，表面会形成一层薄膜，如腐竹的生产一般工业化蛋白质织构化是在光滑的金属表面进行的；（2）纤维形成：纤维纺丝大豆蛋白纺丝：在 pH10 时制备高浓度10-40%的纺丝溶液→脱气→澄清→通过管蕊板，每平方厘米 1000 孔，孔径为 50-150μm→酸性氯化钠溶液（等电沉淀或盐析）→压缩→成品3）热塑挤压：使蛋白质中的含水量为 10-30%，在高压下 10000-20000kPa，使其在20-150s 内温度升高到 150-200℃挤压通过蕊板，一般在蛋白质中加入淀粉可改善其质地。

3 凝胶形成：蛋白质形成凝胶的机制和相互作用至今还没有完全研究清楚，但有研究表明蛋白质形成凝胶有两个过程，首先是蛋白质变性而伸展，而后是伸展的蛋白质之间相互作用而积聚形成有序的蛋白质网络结构影响蛋白质凝胶形成的因素有：（1）蛋白质的浓度：蛋白质溶液的浓度越大越有利于蛋白质凝胶的形成，高浓度蛋白质可在不加热、与等电点相差很大的 pH 条件下形成凝胶2）蛋白质的结构：蛋白质中二硫键含量越高，形成的凝胶的强度也越高，甚至可以形成不可逆凝胶，如卵清蛋白，β-乳球蛋白相反含二硫键少的蛋白质可形成可逆凝胶，如白明胶等3）添加物：不同的蛋白质相互混合，可促进凝胶的形成，将这种现象称为蛋白质的共凝胶作用在蛋白质溶液中添加多糖，如在带正电荷的明胶与带负电荷的褐藻酸盐或果胶酸盐之间通过离子相互作用形成高熔点凝胶4）pH：pH 在 pI 附近时易形成凝胶4 面团形成小麦胚乳中的面筋蛋白质在当有水分存在时在室温下混合和揉搓能够形成强内聚力和粘弹性糊状物的过程水合的面粉在混合揉搓时，面筋蛋白质开始取向，排列成行或部分伸展，这样将增强蛋白质的疏水相互作用并通过二硫交换反应形成二硫键最初的面筋颗粒形成薄膜，形成三维空间上具有粘弹性的蛋白质网络。

影响蛋白质面团形成的因素有很多：（1）氧化还原剂：还原剂可引起二硫键的断裂，不利于面团的形成，如半胱氨酸；相反氧化剂可增强面团的韧性和弹性，如溴酸盐；（2）面筋含量：面筋含量高的面粉需要长时间揉搓才能形成性能良好的面团，对低面筋含量的面粉揉搓时间不能太长，否则会破坏形成的面团的网络结构而不利于面团的形成；（3）面筋蛋白质的种类：利用不同比例的麦醇溶蛋白和麦谷蛋白进行实验，发现麦谷蛋白决定面团的弹性、粘结性、混合耐受性等，而麦醇溶蛋白决定面团的延伸性和膨胀性5 乳化性质蛋白质在许多乳胶体食品体系中起着重要的作用，如牛奶、冰淇淋、肉馅等蛋白质对水/油体系的稳定性差，而对油/水体系的稳定性好影响蛋白质乳化的因素：（1）盐：0.5-1.0mol/L 的氯化钠有利于肉馅中蛋白质的乳化；（2）蛋白质的溶解性：蛋白质的溶解性越好，其乳化性也越好，但蛋白质的乳化性主要与蛋白质的亲水-亲油平衡性有关；（3）pH：有些蛋白质在 pI 时乳化性最好，而有些蛋白质在 pI 乳化性最差；（4）热作用：热不利于蛋白质乳化性的发挥6 起泡性质在食品体系中蛋白质起泡的现象非常常见，如蛋糕、棉花糖、蛋奶酥、啤酒泡沫、面包等。

蛋白质泡沫其实质蛋白质在一定条件下与水分、空气形成的一种特殊形态的混合物影响蛋白质起泡的因素有：（1）盐类：氯化钠一般能提高蛋白质的发泡性能，但会使泡沫的稳定性降低，Ca 2+则能提高蛋白质泡沫的稳定性2）糖类：糖类会抑制蛋白质起泡，但可以提高蛋白质泡沫的稳定性3）脂类：脂类对蛋白质的起泡和泡沫的稳定性都不利4）其他：蛋白质浓度为 2-8%时，起泡效果最好，除此之外还与搅拌时间，强度、方向等有关有时由于蛋白质的起泡而影响加工工艺的操作，要对蛋白质泡沫进行消除，常用的方法就是加入消泡剂——硅油7 风味结合作用蛋白质可以使食品中的挥发性风味化合物在贮藏及加工过程中不发生变化，并在进入口腔时完全不失真的释放出来影响蛋白质风味结合作用的因素有：（1）水：水可以提高蛋白质对极性风味化合物的结合作用，但对非极性风味化合物的结合没有影响；（2）盐：凡能使蛋白质解离或二硫键断裂的盐类，都能提高蛋白质的风味结合能力；（3）水解作用：蛋白质水解后其风味结合作用严重被破坏；（4）热变性：热变性一般会使蛋白质的风味结合作用有所加强；（5）其他：脱水，脂类存在蛋白质的测定方法pro 的测定方法分为两大类：一类是利用 pro 的共性，即含氮量，肽链和折射率测定 pro 含量，另一类是利用蛋白质中特定氨基酸残基、酸、碱性基团和芳香基团测定 pro 含量。

但是食品种类很多，食品中 pro 含量又不同，特别是其他成分，如碳水化合物，脂肪和维生素的干扰成分很多，因此 pro 的测定通常利用经典的剀氏定氮法是由样品消化成铵盐蒸馏，用标准酸液吸收，用标准酸或碱液滴定，由样品中含氮量计算出 pro 的含量由于食品中 pro 含量不同又分为凯氏定氮常量法、半微量法和微量法，但它们的基本原理都是一样的一 凯氏定氮法这种方法是 1883 年 Kjeldahl 发明，当时凯氏只使用 H2SO4 来分解试样，来定量谷物中的pro，他只知用 H2SO4 分解试样，而不能阐明 H2SO4 分解有机氮化合物生成氨的反应历程，所以只使用 H2SO4 分解试样，需要较长时间，后来由 Gunning 加入改进，他改进的办法是在消化时加入 K2SO4 使沸点上升，这样加快分解速度，因为温度由原来硫酸沸点的 380 上升到 400℃，提高了不到 67℃所以速度也就加快了，凯氏定氮法至今仍在使用我们在检验食品中 pro 时，往往只限于测定总氮量，然后乘以 pro 核算等数，得到蛋白质含量，实际上包括核酸、生物碱、含氮类脂、叶啉和含氮色素等非蛋白质氮化合物，故称为粗 pro1 凯氏常量定氮法：不论常量、半微量以及微量定氮法它们的原理都是一样的，首先第一个步骤是消化：（1）消化：样品与硫酸一起加热消化，硫酸使有机物脱水。

并破坏有机物，使有机物中的C、H 氧化为 CO2 和 H2O 蒸汽逸出，而 pro 则分解氮，则与硫酸结合成硫酸铵，留在酸性溶液中2）在消化过程中添加硫酸钾可以提高温度加快有机物分解，它与硫酸反应生成硫酸氢钾，可提高反应温度，一般纯硫酸加热沸点 330℃，而添加硫酸钾后，温度可达 400℃，加速了整个反应过程此外，也可以加入硫酸钠，氢化钾盐类来提高沸点其理由随着消化过程硫酸的不断地被分解，水分的逸出而使硫酸钾的浓度增大，沸点增加加速了有机的分解但硫酸钾加入量不能太大，否则温度太高，生成的硫酸氢铵也会分解，放出氨而造成损失为了加速反应过程，还加入硫酸铜，氧化汞或硒粉作为催化剂以及加入少量过氧化氢，次氯酸钾作为氧化剂但为了防止污染通常使用硫酸铜所以有机物全部消化后，出现硫酸铜的兰绿色，它具有催化功能，还可以作为碱性反应指示剂1）蒸馏：样液中的硫酸铵在碱性条件下释放出氨，在这操作中，一是加入氢氧化钠溶液要过量，二是要防止样液中氨气逸出2）吸收与滴定：蒸馏过程中放出的氨可用一定量的标准硫酸或标准盐酸溶液进行氨的吸收，然后再用标准氢氧化钠溶液反滴定过剩的硫酸或盐酸溶液，从而计算出总氮量半微量或微量定氮通常用硼酸溶液吸收后，再用标准盐酸直接滴定，硼酸呈微弱酸性，用酸滴定不影响指示剂变色反应，它有吸收氨的作用。

1．操作步骤：准确称取样品中 0.50-2.00g→于 500ml 凯氏瓶中→加 10g 无水 K2SO4→加 0.5gCuSO4→加20ml H2SO4→在通风橱中先以小火加热，待泡沫消失后，加大火力，消化至透明无黑粒后，将瓶子摇动一下使瓶壁炭粒溶于硫酸中→继续消化 30 分钟→至到样液呈绿色状态，停止消化，冷却→加 200ml 水→连接蒸馏装置→用硼酸作吸收液→在 K 氏瓶中加波动珠数粒和80ml50% NaOH→立即接好定氮球→加热→至到 K 氏瓶内残液减少到三分之一时，取出用水冲洗→用 0.1N HCl 滴定N（V2-V1）0.014W计算：总氮量%= （N(V2-V1)×0.014）/W × 1000.014----氮的毫克当量数pro%=总氮%×K乳制品 K=6.38（N=15.7%）小麦粉 K=5.79（N=17.6%）动物胶 K=5.6（N=18.0%）冰蛋 K=6.7（N=14.8%）大豆制品 K=6.0（16.7%） K=6.25 则（N=16%） K-换称等数各种试剂的作用:浓 H2SO4：A ：脱水使有机物炭化，然后有机物炭化生成碳，碳将 H2SO4 还原为 SO2，本身则变为 CO2B： 氧化C： pro 与浓 H2SO4 生成 NH3↑，CO2，SO2，H2O↑D： NH3 与 H2SO4 生成硫酸铵（1）CuSO4 的作用（催化剂）CuSO4 为红色沉淀，当 C 完全消化后，反应停止，红色消失，变为兰色，即为消化达到完全，兰色为 CuSO4 的颜色（2）K2SO4 的作用（提高沸点）沸点由 330℃提高到 400℃加速了反应过程。

3）硒粉和过氧化氢，氧化汞都为催化剂，但为了防止污染通常采用硫酸铜（4）50%NaOH 的作用下面我就针对几点来说明为何影响氨化完全和速度快的因素:（1）K 氏烧瓶和取样量如果称 1g 以上的样品，就需要 K 氏烧瓶最小 500ml，800~1000ml 的更好，这样的 K 氏烧瓶对于缩短氨化时间，加热的均匀性和完全氨化效果最好2）分解剂A H2SO4 和 K2SO4 的添加量有机无分解需要 H2SO4 量，H2SO4 应根据有机物种类不同而加的量就不同，如果试样含脂类高，则加 H2SO4 多，为了提高分解温度，要大量添加 K2SO4，但不能太多，也不能太少，太少则氨化不充分K2SO4 和 H2SO4 的添加比例是：1g 样品 K2SO4： H2SO4=7g：12ml这种比例在国内外都使用，是公认的还有一种比例： K2SO4：H2SO4=10：20mlB 催化剂用作催化剂的有 Hg、HgO、Se，硒化合物，CuSO4、T。