2染色体与DNA345--复制培训教材.ppt

2.3 DNA的复制2.3.1DNA的半保留复制机理1、半保留复制的模型和验证模型假设：有三种可能半保留模型（semioconservetivemodel）全保留复制模型(conservetivemodel)分散模型(Dispersivemodel)2.3.2 复制的起点方向和速度 复制结构-复制叉复制子（replicon)通常把生物体的复制单位称为-复制的方向-单向、双向1、 E.coli定点、双向对称复制2、T7在近一端的17处开始，向两端延伸3、枯草杆菌有固定的起始点，双向不对称复制4、质粒R6K早期为单向复制，复制了约1/5基因组进行时双向复制5、质粒Col E1有固定起始点，但却为单向复制6、mtDNA进行D（displacedloop）环复制7、真核有多个复制起点（i），双向等速复制举例：大肠杆菌复制起始点复制速度2.3.3 复制的几种主要方式n虽然DNA均以半保留进行复制，但因DNA在细胞内的存在形式不同，复制叉部位复制方式也不同n主要有：1、线性双链DNA2、环状双链DNA2.3.3.1线性DNA双链的复制n线性DNA的末端序列的合成，可能是完全独立的过程n目前有4种假设：1、线性DNA的转变为环形。

2、线性DNA的末端形成发夹结构3、末端加头或接尾4、与蛋白质结合引发合成举例：腺病毒DNA的复制n腺病毒DNA全长35937 bp线性双链，两端各有反向重复顺序103162bp，两末端各有50bp为复制起点n其复制是以单链置换（strand displacement）形成一个大的茎环或叫平锅形结构来进行的腺病毒新DNA链合成-蛋白质引物n2.3.3.2环状DNA双链复制n依环型DNA的复制过程中间物结构n有3种：1、型复制2、滚环式复制（型复制）3、D型复制1、型复制模式双向复制nE.coli3H-T培养物与放射自显影实验2、滚环复制模型1968年Gilbert提出，要点（1）共价延伸；（2）模板链和新合成的链分开;（3）不需RNA引物，在正链3OH上延（4）只有一个复制叉;（5）形成多联（concatemer）;滚环复制的电镜照片n滚环复制模式3、D环复制模式 单向复制一种特殊形式三种DNA复制的特征对比中间物结构模板方向1、型复制型双链环状分子两条链双向2、型复制型双链环状分子一条链单向3、D型复制D型双链环状分子两条链单向2.4 原核生物和真核生物 DNA复制的特点2.4.1原核生物DNA复制的特点 以大肠杆菌基因组DNA复制为例： 基因组DNA为双链双向型等速复制E.coli双链复制的起始1、主要发生oriC区域。

2、在oriC序列上(245bp)进行复制起始，由形成引发复合物开始，需要6种蛋白质装配成复合物，使环状超螺旋摸板转变为双链广泛解旋的形式反应是在9kb和13kb的重复序列上3、DnaA首先结合在oriC序列的4个9kb重复序列上然后DnaA作用于3个13kb重复序列，使这几个位点的DNA融化解链，形成开放复合物4、前引发复合物能是DNAoriC区域解链约60bp，在oriC区域终止，并引发一段RNA引物复制起始点解链复制起始区的结构特点（1）富含AT，这可能和双链易于解开起始复制有关；（2）含有多个回文结构（914个GATC）8个GATC较保守,CATC中的“A”已甲基化;（3）具有4个反向重复顺序，作为蛋白结合位点；（4）此顺序的右侧毗邻区域有两个启动子，其可能的作用是：转录产生引物；产生复制必要的蛋白；产生调节功能的RNA；起转录激活作用2.4.1.1 DNA双螺旋的解链复制时，DNA双链解开形成复制叉此过程有许多蛋白质和酶参与完成重要的酶和蛋白质有：（1）单链结合蛋白（SSB）（2）DNA解链酶（DNAhelicase)（3）DNA拓扑异构酶(DNAtopoisomerase)单链结合蛋白SSB（single-strandbindingprotein)又称为双螺旋去稳定蛋白（helixdestabilizingprotein）由177个aa组成，在E.coli 中以四聚存在,分子量为74KDa。

n在原核中SSB与DNA结合表现出协同效应1）SSB之间的相互作用；（2）第一个SSB和DNA的结合改变了DNA的结构 DNA解螺旋酶解螺旋酶是拓扑异构酶型酶具有ATPase活性，催化DNA解链，放松负超螺旋有两类：一是在滞后链解螺旋酶二是在前导链解螺旋酶n解旋酶(helicase)复制叉移动带来的拓扑学问题 旋转酶引入负超螺旋的模型n2.4.1.2 DNA复制的引发 引发酶（primase)：一种特殊的RNA聚合酶引物：RNA片段引发体：6种蛋白质（n,n,nDnaB,C)和I共同组成引发过程：前导链引发后随链引发 RNA引物n引物酶催化合成RNA引物n不同生物RNA引物长度不同 原核生物：174和 E.coli为2-5b真核生物：5-10bM13、G4：20-30b 引物酶与RNA聚合酶n引物酶即RNA聚合酶，可从头合成引物n例如：n大肠杆菌的引物酶n分子量60KD，有染色体基因dnaG编码n引物合成长10-60个b.n2.4.1.3 冈崎片段与半不连续复制 半不连续复制假说1968年,日本冈崎（Okazaki)利用放射性同位素示踪培养大肠杆菌实验而证实，提出了DNA半不连续复制模型。

半不连续复制要点：1、复制叉的两条摸板链合成新生链的方式不同，即前导链是连续合成的，后随链是不连续合成的；2、前导链的连续合成总是领先于不连续合成的滞后链；补充：滞后链复制的回环模型n回环模型：DNA双链在复制叉初同时进行复制，在滞后链摸板形成一个环n证据：n回环模型解释2.4.1.4复制的终止1、链的终止不需要许多蛋白质的参与2、当子链延伸达到terminusregion（ter，带有多个20bp序列）时，DNA复制就终止了Ter有点像一个陷井（trap），使复制叉只能进入，不能出来Ter的功能主要是由Ter-Tus复合物（terutilizationsubstance）来完成的Ter-Tus复合物能阻挡复制叉前移，等到相反方向的复制叉到达后，在拓扑异构酶的作用下，使复制叉解体，释放子链 复制陷阱2.4.1.5DNA聚合酶 DNA聚合酶的特点和种类 DNA聚合酶的共同特点是：（1）需要提供合成模板；（2）不能起始新的DNA链，必须要有引物提供3OH；（3）合成的方向都是53（4）除聚合DNA外还有其它功能 DNA聚合酶的种类nDNA聚合酶-校正酶，切除修复酶nDNA聚合酶-酶活性低nDNA聚合酶-主要复制酶nDNA聚合酶-SOS修复酶nDNA聚合酶-SOS修复酶表 E.coli 中的三种DNA聚合酶DNApolDNApolDNApol结构分子量109KD90KD900KD构成单体单体异多聚体分子数/细胞400？10-20酶活性：53聚合酶+35外切酶+53外切酶+(可切单链)突变体突变位点polApolBpolC(dnaE), dnaN, dnaZX, dnaQ, dnaT突变表型修复有缺陷能修复阻止复制 DNA聚合酶I的发现和结构n是第一个被鉴定出来的DNA聚合酶。

n是1956年kornberg(昆伯格）从大肠杆菌中分离出来的又称为kornberg酶n分子量109KD的单链-单体酶n有polA基因编码 DNA聚合酶I的结构DNA聚合酶I的主要位点DNA聚合酶有6个结合位点：n(1) 模板结合位点；n(2) 引物结合位点；n(3) 引物3/OH结合位点；n(4) 底物dNTP结合位点；n(5) 5/3/外切酶结合位点；n(6) 35校正位点 nDNA聚合酶的功能n1.53聚合功能n2.35外切活性n3.53外切活性n4.内切酶活性DNA聚合酶与Klenow大片段来源：是DNA聚合酶（Klenow酶）经枯草杆菌蛋白酶水解成2个片段，大片段为7600，小片段为3400将大片段为7600称谓Klenow大片段功能：具有53聚合功能和35外切活性n DNA聚合酶的结构n全酶由多个亚基（10种22个）组成，即n222222/222n其中组成核心酶，其余为辅助蛋白 DNA聚合酶的亚基组成2.4.2真核生物DNA复制的特点特点：1、有多个复制起始点；2、各个起始点上只能复制起始一次；3、复制的起始需要原点识别复合（ORC）；4、复制叉移动速度慢；5、有15种以上DNA聚合酶。

真核生物DNA的复制n真核生物DNA的复制与原核生物的区别：1、多个复制起始位点；2、不同的复制单元不同时启动；3、复制受调控；真核生物DNA聚合酶哺乳动物有5种（、）主要酶是DNA聚合酶和 真核生物端粒DNA 复制1、端粒是染色体末端的一种特殊结构，是染色体头部和尾部重复的DNA 2、端粒的存在是为了维持染色体的稳定，没有端粒,则末端暴露,易被外切酶水解，据报道说端粒与生命长短有关3、端粒DNA是用端粒酶来合成的，端粒酶中含有RNA模板，用来合成端粒.端粒DNA的序列结构n1、端粒DNA的3端是由数百个串联重复GT丰富的短的寡核苷酸序列n例如四膜虫的重复序列为-GGGGTT-，人为-AGGGTT-n2、端粒DNA序列虽不含功能基因，但对维持染色体的稳定性起着重要作用如果端粒丧失，染色体之间可能出现端-端融合、降解、重排乃至染色体丢失等变化，最后细胞衰亡端粒酶(telomerase)n由蛋白质和RNA两部分组成，其中RNA作为合成端粒DNA的模板，端粒酶是目前所知唯一携带RNA模板的逆转录酶，具有种属特异性n例如四膜虫的端粒酶，其RNA部分含159个核苷酸，其中有一段序列为5-CAACCCCAA-3可作为合成端粒DNA3端GT丰富序列-GGGGTT-模板。

人端粒酶的RNA含450个碱基，其中-CUAACCCUAAC-为合成-AGGGTT-的模板端粒酶复制n是1985年发现的一种核糖核蛋白酶，由三部分组成：端粒酶RNA、端粒酶协同蛋白和端粒酶逆转录酶n该酶兼有提供RNA模板和催化逆转录的功能，通过一种称为爬行模型的机制维持染色体的完整n端粒酶结合后，依其RNA模板，在端粒单链3-OH为引物基础上，不断反向转录，催化其延长，到一定长度，形成G-G配对的发夹结构，3-OH端回折与互补链方向一致，端粒酶脱落，由DNA聚合酶催化，按新延伸的链为模板合成互补链nDNA末端复制变短和用端粒酶增加其长度，这两个过程处于平衡状态，所以染色体保持大致相同的长度小结端粒酶与端粒复制特点n作用：延长端粒 n过程：与之互补，反转录，再互补，再转录一次一个重复序列n分布：生殖细胞和癌细胞 n（体细胞无，所以，体细胞继代培养若干代后即停止分裂甚至凋亡n端粒功能n稳定末端结构，辅助末端复制 补充：真核生物DNA 复制的代表 病毒SV40 DNA复制n病毒SV40 DNA有5243bp.n寄生在猴细胞内，形成具有核小体结构的微染色体复制特点： 1、有自身编码的T抗原参与复制，其余组分来自寄主细胞。

2、 T抗原有类似于oriC复制体系中的DnaA的作用 SV40DNA的复制起始区域SV40DNA的复制起始区序列nSV40DNA的复制过程1、T抗原和RF-A蛋白识别复制起始区， DNA聚合酶、引物酶结合到起始区上，开始合成异端RNA引物；2、RF-C蛋白结合到引物上，促使DNA聚合酶合成前导链的一条片段；随后DNA聚合酶从前导链上解离下来，参与后滞链的合成； DNA聚合酶与RF-C作用结合到前导链的第一段3/-OH末端，继续合成前导链小结细菌和真核复制酶比较组成 细菌 真核n复制酶聚合酶聚合酶n进行性因子夹子PCNAn定位因子复合物RF-Cn引物合成酶引物酶聚合酶n去除引物聚合酶RNaseH1/MF-1n滞后链修复聚合酶连接酶聚合酶连接酶n解螺旋酶DnaBT抗原n消除张力拓扑异构酶拓扑异构酶n单链结合SSBRP-A2.4.3 DNA复制的调控2.4.3.1大肠杆菌染色体DNA的复制调控1、染色体复制与细胞分裂是同步的，但不偶连2、复制的起始与复制。