质粒DNA的提取、定量与酶切鉴定.docx

质粒DNA的提取、定量与酶切鉴定一、实验目的1、掌握PCR基因扩增的原理和操作方法；2、掌握碱裂解法提取质粒的方法；3、 了解紫外吸收法检测DNA浓度和纯度的原理、方法；4、 学习水平式琼脂糖凝胶电泳操作二、实验原理1. PCR：PCR (Polymerase Chain Reaction)即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催 化下，以DNA为模板，特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，在 体外复制DNA的过程① 延伸：溶液反应温度升至中温72°C，在Taq酶作用下，以dNTP为原料，引 物为复制起点，模板DNA的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链；② 变性：加热使模板DNA在高温下90C-95变性，双链解链；③ 退火：降低溶液温度，使合成引物在低温(35-70C, 一般低于模板Tm值的 5C左右)，与模板DNA互补退火形成部分双链2.质粒DNA的提取与定量——碱裂解法：A、基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异；B、高碱性条件下，染 色体DNA和质粒DNA变性；C、当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA复性并保存在溶液 中，染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心形成沉沉淀去除。

D、 定量检测原理：物质在光的照射下会产生对光的吸收效应；而且物质对光的吸收是具有选择性的； 各种不同的物质都具有其各自的吸收 光谱3.酶切鉴定：利用限制性内切酶 4、琼脂糖凝胶电泳：A、 琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径 的大小决定于琼脂糖的浓度；B、 DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动；C、 DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应不同的DNA， 分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带（迁移速 度与分子量的对数值成反比关系）三、材料与方法：（一）、材料 1、样品：菌液（大肠杆菌DH5a菌株）、引物、2*Premix Taq、灭菌离子水、含pMD19-T 质粒的大肠杆菌DH5a 2、试剂：LB培养基、AXYGEN试剂盒（溶液SI、S2、S3、去蛋白液W1、漂洗液W2、洗脱 液EB）、电泳指示剂、Gelview、TBE、琼脂糖、DNA Marker 500、无菌水、10*M 酶切缓冲液 Buf R、HindIII（15U/ul）、EcoR I （12U/ul） 3、仪器与器材：PCR仪、台式离心机、微量加样枪、灭菌的薄壁离心管、凝胶电泳系统、凝胶 成像系统、台式离心机、紫外分光光度计 （二）、方法 1、PCR: 步骤实际操作将装有配好的反应液的PCR反应管置于台式离心机中离心取0.2 ml PCR反应管一只，用微量加样枪按下述顺序分别加入各试剂试剂 灭菌去离子水 2*Premix Taq 引物1 引物2 菌液体积（口L） 5.5 12.5 1 1 5将PCR反应管放入PCR仪中，约1小时30分钟。

2、质粒DNA的提取与定量：往培养物中加入250 ul溶液S1,吹打，使细菌沉淀分散，彻底悬浮加入250 ul溶液S2,颠倒4〜6次混匀，直到溶液变得清亮加入350 ul溶 液S3,立即温和混匀6~8次13000rpm离心10min,小心取上清液（500-800 口 l ）将吸附柱放于收集管中，将上一步所得上清液加入吸附柱中，13000rpm离心3min，弃滤液 加入500 口 l去蛋白液(Wl), 13000rpm离心lmin,弃滤液3、酶切鉴定： 步骤实际操作在一个洁净的1.5ml的EP管中按顺序依次加入以下以下试剂试剂 无菌水10*M酶切缓冲液Buf R质粒 DNA Hind III (15U/ul) EcoR I (12U/ul)用移液枪轻轻混匀(避免产生气泡),37°C水浴1.5h体积(口 1) 9.0 2.0 7.0 1.0 1.0用紫外分光光度计进行定量检测向吸附柱中加入700 U1漂洗液W2,13000rpm离心lmin ,弃滤液 空柱13000rpm离心lmin,然后室温放置3min, 使残留乙醇挥发 取出吸附柱,放入一个干净的离心管中,在吸附膜的中间加 50 口1洗脱缓冲液(Eluent),室温放置lmin, 13000rpm离心lmin洗脱质粒DNA, -20C保存备用。

4、琼脂糖凝胶电泳：凝胶准备一胶床准备一铺胶一静置一胶床置于电泳槽中一加电泳缓冲液一拔 梳子f上样一电泳一取出凝胶一拍照四、结果与讨论：(一)、结果：1、 质粒样本吸光度记录： 测定次数1 2 3 平均值2、 第四个电泳实验本组选取的是质粒以及PCR目的条带DNA 浓度(口 g/ml)109 111 111 110A260/A280 1.64 1.66 1.70 1.67100 250 500 750 1000 1500 2000 3000 5000 质粒 PCR 目的条带由上图可 见，本组的质粒与PCR 目的条带的电泳结果均比较模糊二）、讨论：1、 结果1.62、 根据电泳结果显示：质粒呈3个条带，PCR产物是1个条带条带较其他 结果较模糊，说明所提取的质粒DNA浓度较低根据DNA Marker泳道，可知所 提取的质粒DNA大小约为3000bp，是较为准确的 思考题：1、碱法提质粒中溶液I、II、III、的作用？答：溶液I的作用是溶菌溶液中含有溶菌酶、EDTA，溶菌酶能溶解细菌的肽 聚糖细胞壁，因而具有溶菌作用EDTA可以螯合金属离子，抑制脱氧核酸酶对 DNA的降解作用，同时EDTA还可以加强溶菌酶的溶菌效果。

溶液II的主要作用是：提高碱环境，使染色体DNA和质粒DNA变性；溶液中的 SDS可以溶解细胞膜，解聚核蛋白并且结合蛋白质形成复合物使蛋白质沉淀下 来溶液III起缓冲液的作用，调节Ph至中性使质粒DNA复性；溶液还提供了高盐 环境，有利于大分子染色体DNA、RNA以及SDS-蛋白质复合物沉淀下来2、结 合实验情况，如何提高限制性酶切的反应效率？答：严格执行操作步骤，避免残留太多杂质；提取质粒DNA时使乙醇尽量挥发 干净，以免影响限制酶的活性。