酵母单杂交1课件.ppt

分子生物学技术1. cDNA文库 cDNA文库(complementary DNA library)以组织细胞中的mRNA为模板，反转录合成双链cDNA ，各cDNA分子分别插入载体形成重组子，再导入宿主细胞克隆扩增这些在重组体内的cDNA的集合即cDNA文库构建步骤： 1、高质量mRNA制备：纯化试剂盒，生物素 2、反转录生成cDNA: 反转录酶，oligo(dT) ,R6 3、与噬菌体载体分子连接 4、噬菌体的包装DNA探针：带有特殊碱基序列的单链DNA或RNA分子,可以用放射性物质或免疫性物质标记,通过杂交,DNA探针常用于检测互补的碱基序列 文库中筛选目的基因3.3. 酵母双酵母双( (单单) )杂交的杂交的4.4. 原理及应用原理及应用3.1酵母双杂交体系（Yeasttow-hybridsystem）基于对真核生物调控转录起始过程的认识，高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与反式转录激活因子GAL4：结构包括两部分： DNA结合功能域(DNA binding domain,DNA-BD) 转录激活结构域（activation domain，DNA-AD） 被分开的两者通过适当的途径在空间上较为接近时，才能重新呈现完整的GAL4转录因子活性，并可激活上游激活序列（upstream activating sequence, UAS）的下游启动子，使下游基因得到转录。

双杂交系统组成部分: 选择缺失GAL4编码基因的酵母寄主菌株 表达诱饵蛋白的载体，诱饵即是我们感兴趣的蛋白，它和DNA结合结构域融合. 表达靶蛋白的载体，靶蛋白即是我们要寻找的可以与诱饵相互作用的蛋白，靶蛋白可以是一个已知的蛋白，也可以是cDNA文库编码的蛋白.同诱饵相似，靶蛋白和转录激活结构域融合. 一个或多个报告基因(lacz his3 leu) 将共转化的酵母菌株涂布于选择培养基上，筛选表达相互作用的杂种蛋白（激活报告基因转录）的阳性菌落酵母双杂交的原理BDADUASGAL-LACZ双杂交系统的组成示意图UASGAL-LACZBDADPrey-ADBait-BD 1. 可能与酵母中其他蛋白质的作用有关； 2. 在某些酵母菌株中大量表达外源蛋白质常会带来毒性作用，从而影响菌株生长及报告基因的表型； 3. 为了抑制背景表达而在培养基中添加的3-AT（3-Aminotriazole，氨基三唑，一种除草剂)或6-Azauracil（氮尿嘧啶）也对菌株有一定毒性，使一些蛋白质间较弱的相互作用可能会因此而被掩盖 酵母杂交出现假阳性的原因：酵母双杂交系统的应用： 发现新蛋白和蛋白的新功能 研究抗原和抗体的作用（细胞内） 检测已知蛋白质之间的相互作用 确定末知蛋白之间的相互作用 确定基因治疗中多肽类药物的作用机理酵母双杂交系统的优点 用体内实验来研究蛋白质的相互作用，方法精确，不受外界影响，易于操作; 所有操作均在核酸水平进行，无需纯化大量的蛋白质，可以精确测定蛋白质的弱相互作用； 运用范围较大：酵母双杂交系统中的诱饵蛋白可以是完整的蛋白质，也可以是蛋白质的一个功能区，可以大到一个完整的肿瘤抑制蛋白，也可以小到一个约22个氨基酸的多肽。

酵母双杂交系统的局限性 该系统要求Bait蛋白能够被稳定地表达成融合蛋白，且该融合蛋白必须能被转运到细胞核内，因而不能被转运到细胞核内的蛋白质如细胞浆蛋白、细胞膜蛋白的相互作用的研究就不宜用该系统; 如果某些哺乳动物细胞蛋白质是经过翻译后加工才能相互作用，则该系统也不适用，因为酵母的后加工系统与哺乳动物细胞后加工系统不尽相同.三杂交系统TF:介导蛋白质相互作用的第三种因子. 可以是蛋白质,DNA,RNA或小分子配体两个蛋白之间通过第三者发生相互作用 a 蛋白Z稳定了蛋白A和B之间的作用; b 蛋白质A和B通过蛋白Z相互作用; c 蛋白Z改变了A的结构，使得B能与之作用蛋白质三杂交系统适适用用范范围围酵母单杂交酵母单杂交体系是1993年由Wang和Reed创立的 酵母单杂交体系是借鉴酵母双杂交体系的基本原理，通过观察酵母细胞内报告基因的表达状况，研究DNA一蛋白质之间的相互作用 酵母单杂交系统组成 (1)将文库基因片段与GAL4转录激活域融合表达的cDNA文库质粒； (2)含有目的基因和下游报告基因的报告质粒. （3）三缺型酵母受体：Leu- ，His-，Ura- （Leu，His及尿嘧啶合成缺陷型 ）A cDNA AD融合表达文库AB 双重报道子B筛选cDNA AD融合表达文库的示意图Gal-ADFusedpeptideConstructionoflibrarylaczcyc1IntroducebaitvectorintoyeastLibraryscreeninglaczcyc1Gal-ADFusedpeptide薛红卫2004Galcis基本流程: 构建含靶结合序列的报告载体 转化酵母细胞 检测基础报告表达 筛选AD融合文库 排除假阳性筛选出阳性克隆 扩增阳性克隆，以证实DNA一蛋白质结合活性 进一步分析:酵母单杂交技术的应用(1)确定已知DNA一蛋白质之间是否存在相互作用;(2)分离编码结合于目的顺式调控元件或其他短DNA结合位点蛋白的新基因;(3)定位已经证实的具有相互作用的DNA结合蛋白的DNA结合结构域以及准确定位与DNA结合的核苷酸序列。

4）正向与反向单杂交体系的结合还可用于筛选阻碍DNA与蛋白质相互作用的突变的单个核苷酸酵母单杂交体系的主要优点: 通过筛选DNA文库可直接得到与靶序列相互作用的蛋白质基因序列，而无需分离、纯化蛋白 酵母单杂交体系检测到的与DNA结合的蛋白质是处于自然构象，克服了体外研究时蛋白质通常处于非自然构象的缺点，因而具有很高的灵敏性酵母单杂交体系的缺点: 假阳性结果 由于插入的靶元件与酵母内源转录激活因子可能发生相互作用，或插入的靶元件不需要转录激活因子就可以激活报告基因的转录 假阴性结果 如果酵母表达的AD融合蛋白对细胞有毒性，或融合蛋白在宿主细胞内不能稳定地表达，或融合蛋白发生错误折叠，或者不能定位于酵母细胞核内，以及融合的Ga14 AD封闭了蛋白上与DNA相互作用的位点，则都可能干扰AD融合蛋白结合于靶元件的能力1. cDNA文库构建2. SNP技术3. 酵母双杂交4. 酵母单杂交技术小 结分子生物学技术小测PCR的原理举例说出两种以PCR技术为基础的衍生技术试述RNAi技术的原理和应用分子标记的定义是什么？举例说出2-3种分子标记技术RACE技术基因芯片技术原理及应用。