实验原理 DPPH 在有机溶剂中是一种稳定.docx

实验原理DPPH在有机溶剂中是一种稳定的自由基，其乙醇溶液呈深紫色，在可见光区最大吸收峰为515nm[17-20]，当DPPH溶液中加入自由基清除剂时，孤对电子被配对，吸收消失或减弱因此可用来检测自由基的清除情况，从而评价某物质的抗氧化能力其作用原理如图1图1DPPH自由基清除作用原理Fig・1scavengingPrincipleofDPPHfreeradical1.2.6DPPH自由基清除试验的测定方法将每种供试品溶液分别取20pL加样在96孔板中，再在每个孔中平行加入180pLDPPH溶液同时设立对照组（等量乙醇代替供试液），空白组（20pL乙醇加入180pLDPPH溶液）轻轻振荡，使充分混匀，将96孔板放置在避光环境下反应30min药物与自由基反应完全，在波长515nm处测定，记录最终吸光度（盘）值自由基清除率D=（A对照组一A样品组）/（A对照组一A空白）式中A样品组为加入测试样品后反应液的吸光度；A对照组为对照组未加药的吸光度；A空白为空白组的吸光度为了减小实验误差，每样品设6复孔，6复孔取平均值DPPH・（二苯代苦味酞自由基）在有机溶剂中是一种稳定的自由基,其孤对电子在sl7nm附近有强吸收（显深紫色）。

当有机清除剂存在时，孤对电子被配对，吸收消失或减弱，通过测定吸收减弱的程度，可评价自由基清除剂的活性DPPH•法用以评价天然抗氧化剂抗氧化活性的一种快速（反应时间仅需20min左右）、简便、灵敏可行的方法原理:DPPH・（二苯带苦基麟基自由基）是一个大分子的稳定自由基抗氧化剂预期作用模式为:AH十DPPH・〜DPPH—H十A•依据DPPH•具有单电子，在517nm处有一强吸收（深紫色）,当自由基清除剂与其单电子配对使其吸收逐渐消失,其褪色程度与其所接受的电子数成定量关系,因而可用分光光度法进行定量分析［91N—H2・1・1DPPH标准曲线的绘制分别吸取1、2、4、6、8、10mLDPPH对照贮备溶液，定量转移至10mL棕色量瓶中，乙醇定容，摇匀精密移取200“L加入96孔板中，515nm测其百值以质量浓度为横坐标，百值为纵坐标，绘制标准曲线，每个质量浓度重复3次，取平均值得回归方程百=10.88c+0.075(r=0.9996)有机化合物的热氧化过程是一系列的自由基链式反应，在热、光或氧的作用下，有机分子的化学键发生断裂，生成活泼的自由基和氢过氧化物氢过氧化物发生分解反应，也生成烃氧自由基和羟基自由基。

这些自由基可以引发一系列的自由基链式反应，导致有机化合物的结构和性质发生根本变化抗氧剂的作用是消除刚刚产生的自由基，或者促使氢过氧化物的分解，阻止链式反应的进行能消除自由基的抗氧剂有芳香胺和受阻酚等化合物及其衍生物，称为主抗氧剂；能分解氢过氧化物的抗氧剂有含磷和含硫的有机化合物，称为辅助抗氧剂一胡萝卜素是一种多烯色素，易被氧化而褪去黄色在反应介质溶液中，由亚油酸氧化产生的过氧化物等能使p一胡萝卜素漂白，随时间的延长吸光度越来越小当以吸光度对时间作图时可得到一条下降曲线不同原料的溶剂提取物，按其抗氧化活性的大小不同而使p一胡萝卜素漂白的速度各异抗氧化能力越强，吸光度下降越慢因而不同的曲线有不同的斜率抗氧化能力越强的，曲线斜率绝对值越小邻苯三酚自氧化法邻苯三酚在碱性条件下会自动氧化，不断释放出价•，价•又会进一步促进自氧化过程，生成有色中间产物，先生成的中间产物又不断被氧化成其他中间物，由此邻苯三酚在自氧化过程中出现一系列的颜色变化在邻苯三酚的自氧化初期，中间物的积累浓度(或吸光度)在反应开始30一455后与时间呈线性关系，一般线性时间维持4min左右因此通过测定不同时刻自氧化中间产物的吸光度，并对时间作图，可求得邻苯三酚的自氧化速率,当向体系中加入抗氧化活性物质时，同样可求得。

戈的抑制率I,41氮蓝四哇(NBT)法o气可使NBT还原成蓝色的化合物，其最大吸收波长为560nIn,吸光系数达10000以上，测定灵敏度相当高同时,0入在H十作用下会被歧化成HZOZ在反应体系中若没有抗氧化活性物质存在，则灰的歧化反应很慢，有抗氧化活性物质就会加速歧化反应,因而蓝色化合物的生成量就会减少，所以通过反应体系的吸光度随时间的变化可以测定蔬菜的抗氧化活性［，5］氧自由基吸收能力(ORAC)分析法p一藻红素(p—E)在540刊m光波激发下，可发射565nm的荧光,AAPH在水溶液中可释放过氧自由基，并将p一E氧化,使其荧光特征消失当抗氧化剂存在时可与卜PE竞争氧化剂，减缓p一E荧光消失的速度根据这一特征，可测定氧自由基的清除活性18］C改良的ABTs+法对测定抗氧化活性的ABTS十法进行改良，以提高分析速度、降低分析成本,并将该方法用于水果中抗氧化活性物质提取条件的优化该方法即在酶标板上以Trolox为标准对照，测定抗氧化物质对预先制备的自由基ABTS+的清除能力用不同浓度的乙醇和重亚硫酸钠为提取液,在不同的温度和溶剂P水果比条件下，提取水果blackc叮ant中的抗氧化活性物质，寻找从单位重量水果中提取抗氧化活性水平较高的条件118］。

铁离子还原/抗氧化力FRAP(fetricreducing/antioxidantPowerassay)法原理为Fe3+一三毗陡三叮嗦(triPyridyl一triazine,TPTZ,sigma)可被样品中还原物质还原为二价铁形式，呈现出蓝色，并于593lun处具有最大光吸收,根据吸光度大小计算样品抗氧化活性的强弱［19一1.2.4.4TEAC法Mi!!eretal.了1993)首次报道了TEAC法，并在后来加以改进，改进的方法中氧化齐日ABTS一是由过硫酸氧化ABTsZ一产生的"7mmolABTS铰盐溶于水后，加2.45mmof的过硫酸钾,混合液放置12一16h后得到深蓝色溶液"用乙醇或缓冲液(州7.4)稀释到734nm处吸光度为0.7"取1ml最终的溶液，加loul样品,30OC保温，混合后的1!4!6min测定吸光值"以抗氧化剂浓度和吸光值分别为横纵坐标作曲线,获得与lmMTrolox具有同样吸光读数的抗氧化剂浓度为TEAC值"由于操作简便,TEAC被实验室广泛用于测定抗氧化剂的活性""超氧阴离子，一清除能力测定超氧阴离子自由基是生物体内主要的自由基”它是基态氧接受一个电子后形成的第一个氧自由基，可以经过一系列反应生成其他的氧自由基,引起脂质过氧化导致细胞膜结构和功能的改变,导致细胞膜流动性下降及膜蛋白产生交联"它的测定方法已有一些报道,主要有电子自旋共振!比色法!化学发光法!电化学法和生物传感器法"H202:清除能力测定在低浓度下HZO:活性很低，一般认为在生理条件下,HZO:是与Fe(ll)结合后产生氧化能力"在生物体内,H20:由过氧化氢酶催化产生氧气和水”最常见的测定膳食抗氧化剂清除HZO:的方法中为使用horseradish过氧化物酶来氧化蓑著亭，使之成为无荧光化合物"抗氧化剂存在时,氧化反应被抑制"抗氧化剂通过以下方式抑制氧化反应J与H20:直接反应与酶和HZO:的中间产物反应；»抑制horseradish过氧化物酶与HZO:结合"HO•清除能力测定生物学上一致认为过氧化氢与Fe(II)反应(Fenton反应)产生HO,但是Fe(II)/H20:混合物却不能用于测定抗氧化剂清除Ho.的能力，因为许多抗氧化剂同时也是金属鳌合剂，当样品与Fe(JI)混合后,会通过鳌合来降低铁的活性，结果就不能分辨是由鳌合铁离子引起的还是清除自由基造成的(4)单线态氧(.02)清除光及光敏剂存在时常产生单线态氧，一般也认为单线态氧导致与紫外线有光的皮肤伤害丈Siesetal.,2004),眼睛晶状体的白内障(zigma;1.2000),面部黄斑的发生(Rozanowska.!998)"没有光线时，生物体内几乎不产生单线态氧"超氧阴离子在细胞外的自发性歧化反应可有一定的生理意义(Ta二etal.,2003)”另外，金属或次氯酸盐一叮以使过氧化氢降解产生单线态氧，而不需要发生光反应(Marti,l倪etal.,2000:Aub卿etal.,1985;Busbyetal.,—999)"通过将激发能量转移到其它分子(被激发)或者传给抗氧化剂以形成内过氧化物这些物理方法，单线态氧可被清除"B—胡萝卜素具有清除单线态氧能力"单线态氧在1270nm处发射特征磷光"光强衰变可用来测定化合物清除单线态氧的能力"Fueta>.(>997)报道了一种非常灵敏的方法，用来检测清除四叔丁基酞氰(sDSDF)被单线态氧敏化(703nm)的迟发型荧光"在703nm下测定SDSDF可以使测定方法在普通仪器上进行，因此有可能作为一种灵敏的方法用于测定清除单线态氧的清除而1270二处磷光很难检测”但这种方法还没有被广泛的使用”(5)过氧亚硝酸基(ONOO•—)清除超氧化物与一氧化氮以扩散控制速度形成过氧亚硝酸基(Moncadaetal.,1995)"q—(E"—0.33V)和NO(E性0.39v)非强氧化剂,加成物ONOO.—也不是强氧化剂"但其质子化了的产物,过氧亚硝酸(oNOOH)是非常强的氧化剂(E0三2.10v)"在生理pH条件下，过氧亚硝酸会形成氧化能力较低的硝酸盐(81)"在pH7.4时，过氧亚硝酸基与过氧亚硝酸的比例为4:1,它们常引起芳香化合物硝化和轻基化，尤其使酪氨酸形成硝基酪氨酸#在生理条件下，过氧亚硝基还与溶于体系中的CO:加成，产生对蛋白质有氧化伤害作用的产物"关于清除过氧化氢亚硝酸基的方法报道很少"已经报道的方法有两种J抑制过氧化亚硝酸对酪氨酸的硝化;°抑制玫瑰精的氧化”233.1测试方法细胞毒活性筛选主要采用海虾致死试验(Evidenteetal.2003a)，这是目前科学家们最为信赖的细胞毒活性测试方法之一。

在直径1.8cm,深2cm的每个培养孔中装入0.2mL的人造海水，每个孔中放入人工孵化的游动的丰年虾(Artemiasalina)幼体25-30个将化合物用DMSO溶解，稀释至U10pg•mL-1加入到每个培养孔中，对照只加DMSO,在室温下黑暗培养24h后，在显微镜下计算每个槽中死亡的海虾个数，最后用以下公式计算致死率(M)其中：M=24h后的致死率；A=24h后的死亡总数；B=24h后对照槽中的死亡总数；N=在加入药剂之前的死亡数；G=挑选用于测试的小虾总数(图5)图5细胞毒性测定方法Figure5.Cytotoxicitytestmethod。