重组门冬酰胺酶表达制备纯化方法.doc

重组门冬酰胺酶II的表达 纯化与分析【引言】左旋门冬酰胺酶(Lasparaginase, L SP)是淋巴系统恶性肿瘤化疗方案中的一个很主要 的药物，应用FI趋广泛然而,L SP可产生多种壽副作用，包括急性胰腺炎、药•物性糖尿病、 过敏反应、凝血功能障碍、肝功能损害等，在一定程度上限制了 LSP的临床应用，尤其对于 曾出现上述不良反应的患儿的后续治疗还能不能再用L SP,就成为一个急需解决的问题目前国内所有化学治疗中应用的EC 11主要是依赖进」完成表达EC 11的基因工 程菌株构建，并逐步进行EC II的工业化生产，对于国内ALL的临床化疗有积极意义为 此，我们克隆了EC 11的基因，在大肠杆菌中获得了高效表达，并探讨了其突变复性及后 续纯化的简便方法国内亦开展了类似的工作目的要求】1. 了解基因工程菌发酵培养、分泌表达酶蛋白及表达酶蛋白纯化、分析鉴定的基本原 理2. 掌握以基因工程菌种E.colig晟＞2为材料进行工程菌发酵培养、分泌表达酶蛋口重 组门冬酰胺酶II及表达酶蛋白制备和酶活力测定、SDS-PAGE电泳分析鉴定的工作原理 和技术方法实验原理】L-门冬酰胺酶(L-asparaginase, EC3.5.1. 1)广泛存在于动物的组织、细菌、植物和部 分啮齿类动物的血清中，但在人体的各种组织器官中的分布未见报道。

L■门冬酰胺酶活性形 式为一同源四聚体，每一亚基由330个氨基酸组成，分子质量为34 564u,能专一地水解L- 门冬酰胺牛成L■门冬氨酸和氨山于某些肿瘤细胞缺乏L・门冬酰胺酶合成酶，细胞的存活 需要外源L■门冬酰胺的补充，如果外源门冬酰胺被降解，则由于蛋白质合成过程中氨基酸 的缺乏，导致肿瘤细胞的死亡因此，L■门冬酰胺酶是一种重要的抗肿瘤药物，多年来一肓 是小 儿急性成淋巴细胞性Q ifll.病(Acute Lumphoblastic Leukaemia,ALL)和淋 巴肉瘤 (Lymphosarcoma)临床化疗中重要的配伍药物之一用微生物，特别是人肠杆菌来生产L・门冬酰胺酶已有广泛深入的研究人肠杆菌能产 纶2种天冬酰胺酶，即L■门冬酰胺酶I和L■门冬酰胺酶II,分别由其染色体上基因ansA和 ansB编码只有L■门冬酰胺酶II才有抗肿瘤活性美、徳、丨I均有L■门冬酰胺酶II商品出 flo我国天津生化厂曾于1974年投产，后因菌种退化，产量降低而停产国内目前用药全靠 进口1995年，本院构建了高效分泌表达L■门冬酰胺酶II的基因工程菌，重组L■门冬酰胺 酶II(rL-ASP II)在大肠杆菌细胞中合成后分泌到细胞周质中。

表达的rL-ASP II相对分子质 量为138 356 Da. pl为4.85,紫外最人吸收值在278nm处木实验以此工程菌为材料采用蔗糖溶液渗透振扰提取法和酶解法联用捉収周质中的 rL-ASPII ,再用硫酸憊分级沉淀、DEAE-52阴离子纤维索交换层析等步骤捉取和纯化，得 到较高纯度表达产物rL-ASP II o并对rL-ASPII进行酶活力分析和12%SDS-PAGE电泳分析rL-ASP II酶活性的测定参照Peterson的方法修订取1 ml0.04 mol/L L・门冬酰胺,1 ml 0.1 mol/LpH8.4硼酸■硼酸钠缓冲液，0.2 ml细胞悬液或酶液于37°C保温15 min,速加1 ml 50%三 氯乙酸终止反应，4 000 r/min离心沉淀细胞取上清液1 ml,加奈氏试剂2 ml和双蒸水7 ml, 放置15 min后，于500 nm波长比色在上述规定条件下，将每分钟催化L■门冬酰胺水解释 放1昭分子氨所需的酶量定义为1个酶活力单位(OD500=0.07时为1 U)比活力测定方法为：粘:称纯化产物10mg,溶解于lmlHgO中，采用Lowry法测定蛋白 质含量，并测定酶活力，经以F公式换算即得单位质量的rL-ASP 1【比活力。

rL・ASP II比活 力=酶活力（U）/蛋白含量实验材料】1. 器材（1）基因工程菌菌种：E.M〃pANS2为本实验室保存；（2）其他同前实验二十三器材2. 试剂重组L■门冬酰胺酶II制备和酶活力测定:（1）培养基：种了培养基（LB液体培养基）；发酵培养基（玉米浆培养基）：玉米浆5Og/L,牛肉浸膏35g/L,味精10g/L, pH7.0,高压灭菌接种前在无菌条件下加入抗牛索氨节青霉索2）氨茉青霉素（Amp）；（3）破壁液：45%蔗糖，lOmmol/LEDTA, 200mg/L 溶菌酶，pH 7.5；（4）奈氏试剂：称碘化钾5g加入5ml蒸係水中，边搅拌边滴加25%氯化汞饱和液至稍 有红色沉淀出现再加40ml 50%氢氧化钠溶液，最后用蒸镉水稀禅至100ml,混匀入棕色 试剂瓶中置暗处保存；（5） 1 mol/L 氯化猛（MnCl2）；（6） 5 mol/L 磷酸缓冲液（pH6.4）；（7）pH8.4硼酸缓冲液：0.858g 硼砂（MW=381.37）, 0.680g 硼酸（MW=61.83）,用蒸镭水稀释至100 ml；（8） 溶菌酶;（9） 蔗糖；（10） 氯化钠；（11） 三（羟甲基）胺基甲烷（Tris）；（12） 乙醇；（13） 氢氧化钠;（14） 硫酸馁；（15） 谷氨酸钠（或含99%谷氨酸钠的味精）；（16） 四甲基乙二胺（EDTA）；（17） 盐酸;（18） 玉米浆；（19） 低分子量标准蛋白（14.4〜94KDa）；12%SDS-PAGE电泳分析：同实验九。

实验方法】1. 表达制备方法：一：PCR扩增©SB基因：1模板的制备用接种环挑取菌体少许，在裂解液中震散，95摄 氏度加热10MIN,吸取处理液用于PCR 2扩增条件84°C变形1分钟，60°C复性2分钟,72°C延 伸2分钟，循环28次二：重组质粒PKK 233 ANSB的构建 扩增后的DNA片段及质粒同吋分别用限制醐消 化并用琼脂櫥凝胶电泳分离和回收质粒大片段将消化后的DNA片段和电泳回收的质粒大 片段丿IJ T4DNA连接酶连接，连接产物经琼脂糖凝胶电泳回收后转化，筛选获得相应的阳性 转化子三：阳性转化了的筛选将涂布在含氨节青霉素的LB平板上生长出的单菌落用牙签逐个挑入方格化的新鲜平板上， 为每个克隆编号平板置37°C温箱中过夜，待菌落形成后，川灭菌牙签逐个挑取少量菌 体，移入预先加^O.IMOL/L硼酸缓冲液50UL的酶标板反应孔内，待菌体分散后，每孔 各 加入0.04MOL/L天门冬瞅胺底物溶液50UL,保温37°C，加 奈氏试剂50UL,呈深棕红色孔内 对应的单菌落即为阳性转化子2. 工程菌发酵培养（1） 从平板上挑収菌种接种于新鲜的含氨节青霉素（终浓度为100 Flg/ml ）的LB液体培养 基中，37°C,摇床转速220 r/min,培养至ODgoo为0.48〜0.6h«（2） 摇瓶培养：再按2%接种量转接于发酵培养基（三角瓶20%装液量）中，37°C, 250r/min, 20h, 12 000r/min离心收集细胞。

3） 批式发酵培养：20L的发酵罐装入14L发酵培养基，初始pH值为7.0, 121°C下灭菌 20 min,待温度降至37°C时加氨卡青霉索至最终浓度为100|ig/ml ,接入种子液700ml, 37°C 培养12〜14h,罐压力0.05Mpao3. 重组L■门冬酰胺酚II分离纯化制备（1）廉糠溶液渗透振扰法和酶解法联用提取酶将发酵收获的菌体细胞悬浮于5倍体积的破壁液中，在30°C温和振荡70 min示搅拌F 倾入大量水中，4 °C,边搅拌边加Al mol/L MnCl2（7.5%, V/V）,沉淀核酸和菌体碎片， 8 000r/min,离心30min,收集上清液即得酶提取液采川Lowry法和Peterson修订法分 别检测冃的蛋白重组L■门冬酰胺酶II含量利酶活性及进行12%SDS・PAGE电泳分析计算 收率2） 硫酸钱分级沉淀在酶提取液中加入硫酸镀至55%饱和度，调pH至U7.0,冰水浴磁力搅拌60 min, 4 °C 静置过夜，12 000r/min离心10min除去沉淀再在上清液中加入硫酸镀至90%饱和度， 调pH至等电点附近（约pH5.0）,搅拌60 min, 4 °C静置过夜,12 OOOr/min离心10min, 收集沉淀。

采用Lowry法和Peterson修订法分别检测目的蛋白重组L■门冬酰胺酶II含量 和酚活性及进行12%SDS-PAGE电泳分析计算收率3） 透析脱盐上述沉淀物用5 mol/L磷酸缓冲液（pH6.4）溶解，透析脱盐4） DEAE-52阴离子交换柱层析DEAE-纤维索柱经5 mmol/L磷酸缓冲液（pH6.4）平衡后，上样品脱盐酶液，川相同缓 冲液洗涤至基线平稳，改用50 mmol/L磷酸缓冲液（pH6.4）洗脱，分部收集器收集， 1.5ml/min,M管收集6ml,测定每管的A280值和他活性绘制洗脱曲线收集显示酶活性 组分，冷冻干燥后即得高纯度的L•门冬酰胺酶冻干粉釆用Lowry法和Peterson修订法 分别检测目的蛋白重组L■门冬酰胺酶II含量和酶活性及进行12%SDS・PAGE电泳分析计 算收率4. 重纽L•门冬酰胺酶II酶活性测定吸取lml菌液入Ep管，12 000 r/min离心5min,收集菌体弃去上清，加入蒸懾水lml 洗涤,混悬，12 OOOr/min离心5min,弃上清重复上述操作2〜3次，加入pH&4硼酸缓冲 液lml混悬准备一组（2支）蒸餾水准备管：取10ml的洁净试管2只，每管加3.5ml蒸锚水。

另取2支10ml的洁净试管，分别加入0.04 mol/L天冬酰胺底物，0」mol/L pH&4硼酸缓 冲液各lml, 37°C水浴5min,其中一只加入细胞悬液20卩1,另一支为对照管反应15min后 分别加入50%三氯乙酸lml终止反应再从终止反应管中各支取500卩1进蒸餾水准备管，每 管分别加入与25%NaOH以1:1配好的奈氏液lml显色，500nm处测OD值计算： 酶活力（U）=［（ODx 1000）/（0.07x 15x）］x（3+x/1000）x为取样体积（木实验为20』）5. 比活力测定方法精确称取纯化产物10mg,溶解于1沁出0中，采用Lowry法测定黃白质含量，并测定 酚活力，经以下公式换算即得单位质量的rL-ASP II比活力rL-ASP II比活力=酶活力（U）/ 蛋白含量6. 12%SDS-PAGE电泳分析样品纯度电泳方法同实验九1）按常规制备电泳用聚内烯酰胺凝胶，浓度12%2） 将发酵收获的细胞、酶提取液、硫酸钗分级沉淀和离子交换洗脱液样品处理后，进行 电泳分析3） 电泳2〜3h后,取出凝胶,用0.15%考马斯亮蓝・R250进行染色过夜后倾出染液,不 断脱色，起初每20min换液1次，lh后每小时换液1次，直到区带明显，画出电泳区带图 谱。

7. 结果处理（1） 川箭头图表示重纽L■门冬酰胺酶II制备的操作流程2） 绘制洗脱曲线3 ）重组L■门冬酰胺酣II的纯化过程分析重组L■门冬酰胺酶II的纯化过程分析 纯化步骤 总蛋A （mg） 总活力（U） 比活（U/mg） 纯化倍数收率（％）A. 粗提酚液B. 硫酸彼沉淀C. DEAE-52纤维素柱层析（4）电泳图谱分析。