神经培养技术ppt课件.ppt

神经培育技术神经培育技术山东大学医学院山东大学医学院解剖学教研室解剖学教研室;简简 介介体外培育〔体外培育〔in vitro culturein vitro culture〕包括：〕包括： 组织培育〔组织培育〔tissue culturetissue culture〕〕 细胞培育〔细胞培育〔cell culturecell culture〕〕 器官培育〔器官培育〔organ cultureorgan culture〕〕 就是将活体构呵斥分〔如活体组就是将活体构呵斥分〔如活体组织、细胞或者器官等〕从体内或其寄生体内织、细胞或者器官等〕从体内或其寄生体内取出，放在类似于体内生存环境的体外环境取出，放在类似于体内生存环境的体外环境中，让其生长和发育的方法中，让其生长和发育的方法Ø萌芽：萌芽：18851885年德国学者年德国学者RouxRoux将鸡胚的神经将鸡胚的神经板放入生理盐水中，发现神经板在盐水内板放入生理盐水中，发现神经板在盐水内存活数天存活数天Ø起步：起步：19071907年，年，HarrisonHarrison初次胜利地用蛙初次胜利地用蛙淋巴液培育了蛙胚神经组织，并察看到神淋巴液培育了蛙胚神经组织，并察看到神经细胞突起的生长过程。

经细胞突起的生长过程神经培育的开展历史神经培育的开展历史;Ø开展：在设备、条件和方法上不断改良，开展：在设备、条件和方法上不断改良，尤其是自二战终了后，进入了新的飞速开尤其是自二战终了后，进入了新的飞速开展的阶段展的阶段Ø人类神经系统被公以为是自然界最复杂的人类神经系统被公以为是自然界最复杂的系统神经科学〔系统神经科学〔neuroscienceneuroscience〕已成为〕已成为当今人类医学和生命科学的前沿当今人类医学和生命科学的前沿Ø多个学科、多个研讨领域所进展的研讨，多个学科、多个研讨领域所进展的研讨，均能以神经培育作为研讨手段之一均能以神经培育作为研讨手段之一神经培育与神经科学神经培育与神经科学;一、按培育物的整体性及大小分类一、按培育物的整体性及大小分类 细胞分散培育细胞分散培育 〔〔dissociated dissociated cultureculture〕〕 器官器官- -组织型培育组织型培育 〔器官〔器官型培育〕型培育〕 〔〔organotypical organotypical cultureculture〕〕神经培育的分类神经培育的分类; 可直接按培育的对象命名：可直接按培育的对象命名：如小脑培育，神经节培育，星形胶质如小脑培育，神经节培育，星形胶质细胞培育，少突胶质细胞培育，雪旺细胞培育，少突胶质细胞培育，雪旺细胞培育等。

细胞培育等二、按培育的对象分类二、按培育的对象分类; 静置培育：载片式、试管式、培育瓶式等静置培育：载片式、试管式、培育瓶式等 旋转管培育：不断缓慢转动，以便经常更动旋转管培育：不断缓慢转动，以便经常更动培育液与培育物的关系培育液与培育物的关系三、按培育的方式分类三、按培育的方式分类; 原代培育〔原代培育〔primary cultureprimary culture〕：神经细胞〕：神经细胞普通不再分裂，不传代，故属原代培育普通不再分裂，不传代，故属原代培育 再培育〔再培育〔sub-culturesub-culture〕：把培育物切、割、〕：把培育物切、割、取、弃等修正后，换培育液后再继续培育取、弃等修正后，换培育液后再继续培育 结合培育〔结合培育〔coculturecoculture〕：把两种或两种以〕：把两种或两种以上的组织放在一同进展培育上的组织放在一同进展培育四、其它四、其它 按开创研讨者的名字命名，如按开创研讨者的名字命名，如Maximow双盖片法双盖片法 在培育液中专门参与某种激素、神经生长因子或某些药在培育液中专门参与某种激素、神经生长因子或某些药物而标以某某特殊培育。

物而标以某某特殊培育五、以上方式的综合或特殊设计的培育五、以上方式的综合或特殊设计的培育 综合上述数种方式的培育或培育与移植相结合的特殊设综合上述数种方式的培育或培育与移植相结合的特殊设计的培育等计的培育等 一、一、 无无污染染环境境 二、二、 温度温度 37℃ 37℃ 三、三、 气体气体环境和境和氢离子离子浓度度 95% 95%空气和空气和5%5%二氧化碳二氧化碳 pH pH值为7.2~7.47.2~7.4神经培育所需的环境条件神经培育所需的环境条件;1.1.葡萄糖：较高葡萄糖：较高 2.2.氨基酸氨基酸3.3.维生素维生素4.4.促生长因子促生长因子5.5. 神经生长因子〔神经生长因子〔NGFNGF〕〕6.6.其它其它 四、四、 根本营养物质根本营养物质五、浸透压五、浸透压260~320 mOsm/kg260~320 mOsm/kg;半固体培育基半固体培育基液体培育基液体培育基 ① ①天然培育基天然培育基〔 〔natural mediumnatural medium〕 〕 ② ②合成培育基合成培育基〔 〔synthetic mediumsynthetic medium〕 〕 ③ ③无血清培育基无血清培育基〔 〔serum free mediumserum free medium〕 〕 六、培育基六、培育基; ①①玻璃玻璃①①多聚多聚赖赖氨酸覆着底物氨酸覆着底物 ②②一次性塑料一次性塑料②②细细胞外基胞外基质质成分成分③③细细胞粘附分子胞粘附分子④④单层单层非神非神经经元元细细胞胞七、培育器皿和附着底物七、培育器皿和附着底物;神经培育的根本实验设备神经培育的根本实验设备 普通包括：普通包括： 预备室预备室 无菌操作室无菌操作室 缓冲间缓冲间 进展其它操作的实验间进展其它操作的实验间 一、神经培育室的建立;二、实验室设备二、实验室设备 超净任务台〔super clean bench，hood〕、CO2培育箱、电热枯燥箱、高压蒸气消毒器、冰箱、倒置相差显微镜、解剖体视显微镜、自动纯水蒸馏器、洗刷安装、抽滤安装、离心机、微波炉等;三、器械三、器械四、培育器皿四、培育器皿 1. 玻璃器皿玻璃器皿 2. 塑料器皿塑料器皿;;培育用液培育用液 平衡盐溶液〔平衡盐溶液〔Balanced Salt Balanced Salt Solution, BSSSolution, BSS〕〕 天然培育基〔天然培育基〔Natural MediumNatural Medium〕〕 合成培育基〔合成培育基〔Synthetic MediumSynthetic Medium〕〕 其它其它; 一、水和平衡盐溶液一、水和平衡盐溶液 1. 1. 水：是细胞赖以生存的主要环境。

水：是细胞赖以生存的主要环境 2. 2. 平衡盐溶液：是从平衡盐溶液：是从RingerRinger生理盐水生理盐水开展起来的，主要由无机盐和葡萄糖组成开展起来的，主要由无机盐和葡萄糖组成 PBS PBS、、HanksHanks、、D-HanksD-Hanks、、TyrodeTyrode、、DulbeccoDulbecco、、EarleEarle、、EagleEagle ;几种常用平衡盐溶液的组成成分〔几种常用平衡盐溶液的组成成分〔g/Lg/L〕〕; 1. 1. 血清血清 牛血清牛血清 成年牛血清成年牛血清 新生牛血清新生牛血清 胎牛血清胎牛血清 马血清马血清 羊血清羊血清二、天然培育基二、天然培育基; 2. 胚胎浸出液：胚胎浸出液： 鸡胚浸出液、牛胚浸出液鸡胚浸出液、牛胚浸出液 内含有生长因子、大分子核蛋白和小分内含有生长因子、大分子核蛋白和小分子氨基酸等，有促进细胞生长的作用。

子氨基酸等，有促进细胞生长的作用液体培育基、粉制培育基液体培育基、粉制培育基BEMBEM：：Basal Eagle Medium Basal Eagle Medium 根底根底EagleEagle培培育基育基MEMMEM：：Minimum Eagle Medium Minimum Eagle Medium 低限量低限量 Eagle Eagle培育基培育基DMEMDMEM：：Dulbecco’s Modified Eagle Dulbecco’s Modified Eagle Medium Medium Dulbecco Dulbecco改良改良EagleEagle培育基培育基IMEMIMEM：：Iscove Modified Eagle Medium Iscove Modified Eagle Medium Iscove Iscove改良改良EagleEagle培育培育基基三、合成培育基三、合成培育基; 四、无血清培育基四、无血清培育基 以合成培育基配成根底培育液，再补加以合成培育基配成根底培育液，再补加其它成分。

其它成分1. 1. 根底培育液根底培育液 Ham F12 Ham F12和和DMEMDMEM混合培育液混合培育液 DMEM/F12(1:1) DMEM/F12(1:1) 神经元根底培育基〔神经元根底培育基〔neurobasal neurobasal mediummedium〕〕;2. 2. 生长附加成分生长附加成分比较通用的：比较通用的：胰岛素、转铁蛋白、硒酸钠、孕酮、腐胺〔胰岛素、转铁蛋白、硒酸钠、孕酮、腐胺〔丁二胺〕丁二胺〕B-27B-27、、N-2N-2〔〔GibcoGibco〕〕; 全培液全培液 以下各种成分各以下各种成分各10 ml配制成全配液配制成全配液40 ml〔葡〔葡萄糖含量萄糖含量为6g/L〕：〕：胎牛血清胎牛血清DMEM九天九天鸡胚渗出液胚渗出液Glucose/BSS〔〔5%葡萄糖溶液葡萄糖溶液 4.7 ml，，Tyrode’s BSS 5.3 ml〕〕; 其它常用溶液其它常用溶液 1. 消化液消化液 ①①胰蛋白胰蛋白酶酶溶液溶液〔 〔trypsin solution〕 〕 适于消化适于消化细细胞胞间质间质〔 〔主要是主要是纤维纤维〕 〕较较少的少的软组织软组织。

需用不含需用不含Ca2+和和Mg2+的平衡的平衡盐盐溶液配制溶液配制 用血清或含血清的培育液以用血清或含血清的培育液以终终止消化作用止消化作用 0.25%、、0.125%、、0.08% ; ②②胶原胶原酶酶溶液溶液 〔 〔collagenase solutioncollagenase solution〕 〕 对对胶原有胶原有强强的消化作用，适于消化成的消化作用，适于消化成年的背根神年的背根神经节经节等等纤维较纤维较多的多的组织组织此酶酶作用作用缓缓和，且无和，且无须须机械震机械震荡荡 Ca2+ Ca2+、、Mg2+Mg2+和血清存在下仍有活性和血清存在下仍有活性 ;③EDTA③EDTA溶液溶液 EDTA EDTA〔 〔二乙胺四乙酸二二乙胺四乙酸二钠钠〕 〕是一种化学螯是一种化学螯合合剂剂，，对细对细胞有一定的离解作用，毒性小，胞有一定的离解作用，毒性小，价价钱钱低廉，运用方便低廉，运用方便2. pH2. pH调调整液整液①NaHCO3①NaHCO3液液 7.4% 7.4%、、5.6%5.6%、、3.7%3.7%②HEPES②HEPES液液〔 〔羟羟乙基乙基哌嗪哌嗪乙硫磺酸乙硫磺酸〕 〕 终浓终浓度度10~50 mmol/L10~50 mmol/L;3. 3. 抗生素液抗生素液①①青霉素青霉素 100U/ml 100U/ml②②链链霉素霉素 100μg/ml 100μg/ml4. 4. 谷氨谷氨酰酰胺溶液胺溶液 常配成常配成100100倍倍〔 〔200 mmol/L200 mmol/L〕 〕 终浓终浓度度1~4 mmol/L 1~4 mmol/L ;5. 5. 有有丝丝分裂抑制分裂抑制剂剂①①阿糖胞苷阿糖胞苷〔 〔ara-cara-c〕 〕 3~5 μg/ml 3~5 μg/ml②5-②5-氟脱氧尿氟脱氧尿嘧啶嘧啶;神经培育的根本技术程序神经培育的根本技术程序培育前预备培育前预备新颖组织取材新颖组织取材培育接种培育接种标本维持标本维持察看记录察看记录;培育前预备培育前预备 1. 实验室预备实验室预备 2. 器皿预备器皿预备 3. 液体预备液体预备 4. 动物预备动物预备;取材取材 新颖、无菌新颖、无菌 动作轻柔，切忌损伤组织动作轻柔，切忌损伤组织 熟练，操作时间过长会添加污染时机熟练，操作时间过长会添加污染时机 取材时要滴加平衡盐溶液以防枯燥取材时要滴加平衡盐溶液以防枯燥培育接种培育接种 包括组织块接种和单细胞悬液接种。

包括组织块接种和单细胞悬液接种 器官器官-组织型培育组织型培育 组织不能太大，通常以薄片方式，厚度普通不超越组织不能太大，通常以薄片方式，厚度普通不超越1 mm ;细胞分散培育细胞分散培育 细胞分散培育是从细胞分散培育是从2020世纪世纪5050年年代才逐渐开展起来的代才逐渐开展起来的 神经细胞分散培育那么开场于神经细胞分散培育那么开场于19521952年由年由MosconaMoscona进展的鸡视网膜细胞的进展的鸡视网膜细胞的分别培育分别培育神经组织的分别神经组织的分别 分散细胞的目的在于使细胞分散细胞的目的在于使细胞之间的衔接解离，制成单细胞悬液之间的衔接解离，制成单细胞悬液 常用的分散细胞的方法有：机常用的分散细胞的方法有：机械分散法和消化分别法械分散法和消化分别法 ;标本维持标本维持 37℃ 5% CO2 培育箱 改换培育液 普通2~3天;察看记录察看记录肉眼或放大镜下察看肉眼或放大镜下察看倒置相差显微镜察看倒置相差显微镜察看电子显微镜察看电子显微镜察看;;新生大鼠基底神经节神经元的分散培育新生大鼠基底神经节神经元的分散培育1.1.取新生取新生1 1天大鼠天大鼠1 1只，只，75﹪75﹪酒精棉球消毒后取心脏酒精棉球消毒后取心脏处死。

处死2.2.剪除头颅处皮肤，充分暴露颅顶骨于颅顶骨基剪除头颅处皮肤，充分暴露颅顶骨于颅顶骨基底环状剪开，小心去除，切勿损伤脑组织底环状剪开，小心去除，切勿损伤脑组织3.3.从后内侧向前外侧用眼科镊小心翻去大脑皮层，从后内侧向前外侧用眼科镊小心翻去大脑皮层，暴露基底神经节暴露基底神经节4.4.小心夹取基底神经节组织，放入有小心夹取基底神经节组织，放入有1 ml D-Hanks1 ml D-Hanks液的小烧杯内，眼科剪剪成液的小烧杯内，眼科剪剪成1 mm31 mm3组织块5.5.把把组织块组织块移到离心管内，吸除多余的移到离心管内，吸除多余的D-HanksD-Hanks液后用液后用0.125﹪0.125﹪胰胰酶酶1 ml 37℃1 ml 37℃消化消化30 min30 min时时间间不定不定6.6.50μl50μl胎牛血清胎牛血清终终止消化，滴管小心吹打，打止消化，滴管小心吹打，打散散组织组织7.7.200200目目铜铜网网过滤过滤，离心，离心1000 r/min5min1000 r/min5min8.8.弃上清，用含弃上清，用含10﹪10﹪胎牛血清胎牛血清DMEM/F12DMEM/F12培育液重培育液重悬悬悬悬堆堆积积物，物，计计数板数板计计数，数，调调整整细细胞密度胞密度为为5×105/ml5×105/ml。

9.9.六孔培育板每孔六孔培育板每孔2 ml2 ml培育液，置于培育液，置于37℃37℃饱和和湿度含湿度含5﹪CO25﹪CO2空气的培育箱内培育空气的培育箱内培育10.10.24 h24 h后全量后全量换液，以后每隔液，以后每隔2 2天全量天全量换液假设杂质较多可在多可在 培育第培育第3 3天参与天参与终浓度度为5μg/ml5μg/ml的阿糖胞苷作用的阿糖胞苷作用24 h24 h后后换液。