细胞损伤模型.doc

一、体外肝细胞损伤模型建立（CCl4和H2O2）1　大鼠肝细胞的分离和培养　大鼠4％戊巴比妥麻醉，门静脉插管，先以无钙灌流液灌流，继以37℃通入O2的Ⅳ型胶原酶灌流液继续循环灌流15 min将肝脏移至一平皿内，轻轻撕去肝包膜后，加入含5％小牛血清的清洗液，用吸管吹打成单个肝细胞悬液，200目尼龙网过滤，低速离心（500 r·min-1，1 min，4℃）弃上清，同法用清洗液反复洗3次然后用完全1640培养液（内含10％小牛血清，105　U·L-1青霉素，100 mg·L-1链霉素和10 mg·L-1胰岛素）制成1×109个·L-1肝细胞悬液分离的肝细胞经0.6％台盼蓝拒染法测得细胞活力不小于90％，高碘酸雪夫反映显示糖原法鉴定99％为肝实质细胞将上述肝细胞悬液分别加入24孔（每孔1 ml）和96孔（每孔0.1 ml）培养板中，置37℃，5％CO2培养箱中培养12～16 h后可见肝细胞贴壁于培养板孔底上生长2　CCl4诱导肝细胞坏死性损伤模型的建立　肝细胞培养12 h后，吸弃上清，更换培养液并加入不同浓度的CCl4〔（1～16　mmol·L-1），以少量的二甲亚砜助溶，二甲亚砜终浓度为0.1％（体积分数）〕，作用不同步间（1～12 h）后，收集24孔板中培养上清检测AST，以及肝细胞的MDA含量和GSHpx活性；同步测定96孔板中培养肝细胞的MTT反映。

根据检测成果制备CCl4诱导肝细胞损伤的量效和时效曲线选择最造损伤浓度和损伤时间制备肝细胞的损伤模型，同步设溶媒对照组，每组至少设3个复孔3　H2O2诱导肝细胞坏死性损伤模型的建立　同法更换培养液，加入不同浓度的H2O2（0.2～3.2 mmol·L-1），作用不同步间（0.5～4 h）后，收集24孔板中培养上清检测ALT，测定肝细胞的MDA含量；同步测定96孔板中培养肝细胞的MTT反映根据检测成果制备H2O2诱导肝细胞损伤的量效和时效曲线，选择最适损伤浓度和损伤时间制备肝细胞的损伤模型，同步设溶媒对照组，每组至少设3个复孔4　检测指标（1）  AST、ALT的测定　培养的肝细胞经离心（1 800 r·min-1，10 min）后收集上清，按试剂盒阐明书环节测定上清液中AST和(或)ALT活性，成果以U·(106 cell)-1表达2）  肝细胞增殖实验　采用MTT比色法3）  肝细胞谷胱甘肽过氧化物酶（GSHpx）活性的测定　先制备GSH原则曲线弃肝细胞培养上清，加入0.2％ Triton-100水溶液0.5 ml，混匀，2 min后，离心（2 500 r·min-1，10 min），取上清液（肝细胞样品）0.4 ml，另设样品空白管，非酶反映管和试剂空白管，加入多种试剂。

混匀后立即计时，静置12 min后，以样品空白管调零点，于423 nm波长处读得吸光度（A）值在GSH原则曲线上查出相应的GSH波度GSHpx酶活力单位是在37℃，pH6.5条件下，每106个肝细胞、每分钟使GSH浓度下降1 μmol为1个酶活力单位计算公式为：GSHpx活力单位=（［GSH］非酶管-［GSH］样品管-［GSH］试剂空白管）/3成果以U·(106 cell)-1表达4 ） 肝细胞丙二醛（MDA）含量的测定　先制备MDA原则曲线弃肝细胞培养上清，加入生理盐水1 ml，混匀，移入离心管中，离心（2 500 r·min-1，10 min），弃上清，加15％ TCA 2 ml，破坏细胞并沉淀蛋白质，加入0.67％ TBA 2 ml，于沸水浴中加热30 min根据样本的吸光度值在原则曲线上查出相应的浓度，成果以 nmol·(106 cell)-1表达5）  数据解决　数据以±s表达，计量资料组间比较采用t检查两变量间互相关系，采用直线有关和回归分析二、体内肝损伤模型（酒精）1、材料　纯系SD雄性大鼠，体重180g～200 g，由浙江大学医学院实验动物中心提供食用酒精选用北京酿酒总厂出品的56度红星二锅头。

2、措施　将大鼠随机提成5组，饲养在23℃～25℃室内，自由进食、进水；根据大鼠体重，A、B、C、D组每日用56°红星二锅头白酒以10ml/1Kg分别灌胃 0、4周、8周和12周；E组于酒精灌胃12周后，停止灌胃4周大鼠通过股动脉采血处死，收集血浆和肝脏标本3、重要指标检测（1）肝功能：应用日立7170自动生化分析仪测定总蛋白（TP）、白蛋白（Alb）、球蛋白（Glb）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）等2）氧化抗氧化物质测定：采用南京建成生物工程研究所提供的试剂盒分别检测丙二醛（MDA）、谷胱甘肽过氧化酶(GSH-Px)、谷胱甘肽（GSH）、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽-S-转移酶（GST）3）大鼠肝脏病理检查：大鼠处死后立即取出肝脏，称重后一部分以10%的福尔马林液固定作病理，作常规石蜡切块并HE染色，在光学显微镜下进行观测，用半定量法分别鉴定脂肪变性、及酒精性肝炎炎症活动度三、四氯化碳体外损伤肝细胞模型原代培养的正常大鼠肝细胞培养24h（贴壁良好）后，置培养皿于一密闭的塑料盒，内置四氯化碳0.4M容积，37度90min，导致肝细胞损伤的模型，后转入正常培养，进行下一步实验。

即熏蒸法)肝细胞培养12h后，吸弃上清，更换培养液并加入CCL4 8mM（事先用DMSO溶解，DMSO终浓度1％），作用6h后收集24孔板中培养上清检测AST以及肝细胞MDA含量盒GSHpx活性，评价损伤限度常用措施）四、醋氨酚体外损伤肝细胞模型肝细胞培养24h后，用清洗液洗2次，培养液洗1次，然后换以20mM醋氨酚的培养液，继续培养12h，取培养液，进行下一步实验五、过氧化氢体外损伤肝细胞模型肝细胞培养24h后，吸弃上清液，更换培养液并加入H2O2 0.6mM，作用1h后，收集24孔板中的培养上清液检测AST活性和MDA含量六、氰化钾缺氧肝细胞损伤模型肝细胞培养24h后，贴壁生长良好的肝细胞中加入氰化钾2.5mM，继续培养2h，定量检测培养液上清中LDH活性，以及酶的活性反映肝细胞损伤限度本模型可以更好的模拟缺氧损伤七、硫代乙酰胺（TTA）体外肝细胞损伤模型肝细胞预培养24h后，贴壁生长良好的肝细胞中加入TTA0.18mM，继续培养48h，肝细胞大量损伤和坏死，上清液中乳酸脱氢酶（LDH）活性升高，导致体外损伤肝细胞模型八、内毒素体外损伤肝细胞模型贴壁生长良好的肝细胞中加入内毒素70uL/mL，置37度，5％CO2培养此时上清LDH活性升高导致肝细胞损伤模型，导致体外肝细胞损伤模型。

九、半乳糖胺（GalN）体外损伤模型分离肝细胞，预培养12-24h后，待细胞贴壁生长均匀后，加入5mMGalN的肝细胞培养液，继续培养1.5h，测定培养上清液中ALT，ALT明显升高时，肝细胞造模成功十、帕金森体外模型体外培养的中脑多巴胺能神经元MPTP损伤模型l实验操作：实验采用胚胎龄14一16天的大鼠，剖子宫取胎，取胎鼠中脑腹侧区可将多种胚胎来源的组织收集在一起，置Fl2培养基（Gibco）至35mm的培养皿中，以细剪刀剪碎将2ml含0.125％的胰酶的F12加入到组织中，该混合物于37℃孵育10分钟后，加入DNase I（Sigma）至终浓度80ng／m1，继续于37oC孵育10分钟消化后的组织以尖端被火抛光的移液管轻轻吹打8次该细胞悬液以种植培养基稀释（种植培养基： MEM，补充以2mm谷氨酰胺，6mg/ml葡萄糖，1mg／ml谷胱甘肽，10 units／ml青霉素，10ul/ml链霉素和7.5％胎牛血清）细胞然后种植于35mm的预先以10ug／m1 po1y1ysine （Sigma）和2.5ug／ml merosin（Chemicon）铺底的培养皿中，种植密度为50,000细胞／cm2。

培养16小时后，培养基换为无血清培养基该培养基为F12和basa1Eag1e’s medium，补充以33mM葡萄糖，2mM谷氨酰胺， 15 mM碳酸氢钠，10mM HEPES（pH7.0），1ug／ml谷胱甘肽，20ug/ml胰岛素， 100ug/ml转铁蛋白， 60uM腐胺，20nM孕酮，20nM亚硒酸钠（NaSe），30nM三碘甲状腺原氨酸，0.5 unit/ml青霉素和0.5mg/ml链霉素毒物解决：于第4天以1uMMP+解决48小时然后进行分析模型评价：倒置显微镜下观测细胞形态、细胞计数、免疫组化检测TH阳性细胞的数目和形态体外培养的中脑多巴胺能神经元6-OHDA损伤模型采用上述措施选择胎鼠，分离中脑腹侧部，解剖显微镜下仔细剔除脑膜和血管，用高糖T-BSS反复冲洗涤之七遍并将组织剪碎，移入0.25％胰蛋白酶溶液中，37oC振荡消化30分钟，后加入血清数滴终结消化，用吸管轻轻吹打后，加入不含血清的DMEM培养液混匀，1000rpm，10min离心收集细胞，反复2次，后加入含血清的完全DMEM培养液悬浮细胞，过220目不锈钢筛网使成单细胞悬液，计数后将约3×106个细胞接种人事先涂有多聚赖氨酸的35mm的六孔培养板中，置37oC、5％CO2培养箱中培养。

24小时后待细胞完全贴壁时，置换旧培养液，后来每隔2天更换一次培养液培养至第六天时加入100uM的6-OHDA解决3小时后吸出在相应备孔中加入完全DMEM培养液洗涤2遍，再加入完全DMEM培养液继续置5％CO2培养箱中培养24小时，采用与上述相似的措施做免疫细胞化学染色，计数TH阳性细胞，确立6-OHDA对体外培养的多已胺能神经元的损伤作用十一、Ａβ损伤模型取出生1-2d的乳鼠，用麻醉剂处死在D-hanks液中取大脑并分离海马组织，胰蛋白酶消化，获得细胞悬液，胎盘蓝染色进行死活细胞记数，将细胞以5×105/ml的密度接种于预先经L-多聚赖氨酸解决的96孔和24孔培养板,其中24孔板中预先放置有盖玻片细胞维持在培养液中，置入5%CO2，饱和湿度的培养箱中培养，24h后全换液，接种当天为第一天,每3d半量更换培养液一次，培养第3天时加入阿糖胞苷,终浓度为10μmol/Ｌ,以克制神经胶质细胞的过度增殖,24ｈ后更换所有培养液继续培养,第10天进行细胞造模，开始实验也可以用PC12细胞株,常规培养Ａβ产物诱导海马神经细胞，建立细胞模型：选择Ａβ25-35片段,用三蒸水配制成100μmol??Ｌ-1,过滤,分装,-20℃冻存;使用前老化解决并配制成所需浓度。

将Ａβ25-35溶解在DMSO中，在用DMEM稀释，置于37℃下孵育7-14天，即为老化状态）细胞模型建立:加入浓度为20??mol/L的Ａβ25-35,接触24h,诱导建立AD细胞模型.检测指标:MTT LDH 凋亡 细胞内钙离子 以及SOD等十二、抑郁症的体外模型抑郁等精神疾患的发生也许与过量GC对海马的选择性损伤有关,但机理不明,Heuser和Cosi等报道也许是由于高浓度GC导致神经营养因子体现水平减少导致的,而抗抑郁剂不仅使GC受体上调,HPA轴反馈恢复正常,并且使神经营养因子体现升高,达到治疗目的.PC12细胞株为大鼠嗜铬细胞克隆化细胞株,分化的PC12细胞有典型的神经细胞特性,其胞膜上GC受体体现丰富[6].本文根据文献措施以高浓度皮质酮(corticosterone)模拟抑郁及焦急症神经细胞损伤状态实验操作(MTT法测定细胞存活力)嗜铬细胞瘤株PC12细胞.用含5%胎牛血清及5%马血清的DMEM培养基(含青霉素钠200kU.L-1,链霉素100mg.L-1pH7.4)调细胞密度为。