人心肌肌钙蛋白I（CTNI）胶体金免疫层析分析法的研究.pdf

中国伤和蟹科大孝 中国酱学针辱既硕士研究生学位论文中国协和医科大学研究生院．0中嗣医学科学院中国协和睦辩大学硕士研究生学位论文摘要爨兹巍王数化髫家，，§纛管痰病是藏胁太类垒愈豹耋要疾病之一，发瘸攀帮甏亡率均缀高，蹲鼗类疾病遴嚣零麓诊凝耨浚疗其骞耋大意义心薤瘸静诊断包摇滔寐表琥，，玉瘫臀麓嶷往移心虢豢伤生能标恚耪瓣实验室检测，其中心瓤损伤生证据恚携熬检测程心瓤按伤藉急瞧，洛瓤梗死戆诊断方嚣越霾蘩作掰焉罨找和撵选擘麓、灵敏、特器熬心瓤损伤标悫物帮麓使、侠旋、灵敏静检测努析方法，一蕊怒该领域静重要研究内容隧着对心魏损爨标恣耱豹深入礤究嚣长期静灏瘴实跤验证，虢嚣常帮酌标志甥妇A S T 2 ．1 为阳性，其中P 和N 分别为阳性孔和阴性孔的0 D 2 ．2 抗原包被最佳浓度的选择在实验中抗体需要采用间接E L I S A 法检测，由于各实验室采用的c T n I 抗原来源不一，文献报道c T n I 抗原包被浓度各不相同，但多集中在I - i o ug ／m 1 之间为了确定最佳包被浓度，我们采用3 个抗原包被浓度进行检测，发现5ug ／m 1包被浓度检测效果最佳 见图7 )中国医学科学院中国协和医科大学硕士研究生学位论文结果0 D 4 9 2 Ⅷ图7 最佳抗原包被浓度的选择注：以上数据均采自3 号家兔。

2 ．3 用天然人c T n I 抗原制备抗原包被板将本实验室以前用生物化学方法提取的人c T n I 抗原制备抗原包被板，抗原包被浓度5 p g ／m l ，用间接E L I S A 法测家兔血清抗体效价水平，检验本课题选取的c T n I 肽段与天然c T n I 的交叉反应其中3 号家兔血清抗体效价可达到l ：i 0 0 0 0( 见表2 ) ，说明本实验课题选取的c T n I 肽段制备的抗体与天然c T n l 具有很好的交叉反应，用此抗体可进行后续实验，制备胶体金免疫层析试剂盒中国医学科学院中国协和睡科大学硕士研究艇学位论文结果表2 免疫家兔E L I S A 法检测结果O D a n 天然c T n I 抗原瓴被浓度5 ¨g ／m 1 )家兔编号稀释度123l ：2 0 0 0 00 ．1 0 20 ．1 1 70 ．1 9 91 ：1 0 0 0 0o ．1 1 7o ．1 5 5⑩l ：5 0 0 00 ，1 2 80 1 9 10 ．3 5 81 ：2 0 0 00 ．1 7 30 ．2 8 30 ．4 9 6l ：1 0 0 00 ．2 9 60 ．3 7 10 ．5 8 2l ：1 0 00 ．4 5 20 ．4 7 60 。

7 6 51 ：l O0 ．6 2 00 ．5 9 00 ．8 2 6空白对照O ．1 1 2臻往辩照0 1 3 6注：以上数值均为酶标仪在4 9 2 n m 处测定的0 D 德，P ／N 比值> ／2 1 为阳憾，其中P 帮N 转剐为粥往我帮阴性孔静∞_ 2 ．4 用c T n I 合成肽纯晶制备抗原镪被援，抗原包被浓度5 # g ／m ! 交予3 号家兔斌清抗体与天然c T n I 抗鬣鼠有穰葑煞交叉，本实验翔c T n I合成肽纯品制备抗原包被板，选取3 号家兔进杼抗体效价的梭测，抗体效价可达到1 ；2 0 0 0 0 ，进一步诞实了本实骏选取的c T n I 肽段具有较骥靛亲水性，凌空阕构蒙上与天然静c T n I 抗原具有胡似性，搏藏摭体奄l 备胶俸愈免疫层析试荆盒可以提高检测的敏感性和特异性中国医学科学院中国协和医科大学硕士研究生学位论文结果表33 号免疫家兔E L I S A 法检测结果O D 抗原包被浓度5J ．t g ／m 1 )用不同抗原制备包被板稀释度c T n I 合成肽纯品c T n I 合成肽与K L H 连接物1 ：2 0 0 0 0 0O ．1 4 40 ．9 2 5l ：1 0 0 0 0 0O ．1 6 00 ．9 5 31 ：5 0 0 0 00 ．2 2 51 ．1 9 21 ：2 0 0 0 0偷1 ．0 2 6 ＼、———／1 ：1 0 0 0 00 ．4 5 80 ．9 2 31 ：5 0 0 00 ．6 7 31 ．1 1 l1 ：1 0 0 01 ．1 2 70 ．8 2 81 ：1 0 00 ．9 6 51 ．1 5 6空白对照0 ．1 1 8阴性对照0 ．1 5 7注：以上数值均为酶标仪在4 9 2 n m 处测定的O D 值，P ／N 比值≥2 ．1 为阳性，其中P 和N 分别为阳性孔和阴性孔的o D 。

2 ．5 兔抗人c T n I 合成肽多克隆抗体亲和力的鉴定f 2 6 】亲和力表示抗体与抗原结合的紧密程度，以亲和常数K a 表示，亲和常数以浓度的倒数为单位，即：克分子浓度“( m o l “) 其值越高表示抗原抗体结合的紧密程度越高对不同抗体，亲和常数具有一个很大的范围可从1 0 ”～1 0 5m o l _ 1或更小本实验采用非竞争性E L E S A 法测定抗体的亲和常数，这是美国D a v i dB e a t y 用包被抗原检测抗体的方法，通过质量作用定律归纳出一个以抗体浓度计算抗体亲和常数的方法本实验中以c T n I 合成肽制备抗原包被板，包被浓度梯度为5 “g ／m l 、2 ．5 1 1 9 ／m 1 、1 ．2 5 斗g ／m l 、0 ．6 2 5 D g ／m l ( 8 ：4 ：2 ：1 共4 个浓度梯度) ；将纯化的抗体以P B S 稀释成1 0 个浓度梯度4 0 、2 0 、1 0 、5 、2 ．5 、1 ．2 5 、0 ．6 2 5 、0 ．3 1 2 5 、1 ．5 6 2 5 ×1 0 _ 7 ．8 ×l O _ 2 ( 肛g ／m 1 ) 均加入各浓度包被的抗原孔中国医学科学院中国协和滕科大学硕士研究嫩学位论文结果中，测定o D ；。

值并份出曲线，见图8图8 抗体的抗原结合曲线以5 ％递减法确定如A 、B 、C 、D ( 豳上至下) 四条曲线的结合反应坪( A 、B 、C 、蚤努麓代表5 秘g ／m l 、2 5 弘g ／m l 、t ．2 5 ≯g ／m i 、0 ．6 2 5 | | g ／m l 麓拣添包被滚发，器者浓度之比为8 ：4 ：2 ：1 ) ，通过作图法取其最大0 D 值一半( 即0 D 5 0 ％) 处对应的抗体浓度，A 曲线浓度为5 2 n g ／m l ( 通过计算为3 ．4 6 7 X1 0 “％) 、B 曲线浓度为弱n g 屈l ( 3 8 6 7 X1 0 ≮) 、C 鏊线浓度秀5 2n g 内l ( 4 1 3 3 ×1 0 麓) 、D 麓线浓度为1 1 0n g ／m l ( 7 ．3 3 3 X 1 0 “％) 由抗原抗体结合反成进程中的质爨作用定律( L a wo fM a s sA c t i o n ) ，可以推导崮当[ A g ] 甚= n [ A g ’j 《辩，慧有K a 一- n 一1 ／2 ( n [ A b ’】§一【矗b 】§) ( K a 为亲亵鬻数傻) 将实验测定的0 D 5 0 ％代入上述公式，有如下结果：见表4表4 抗体K a 值测定结果n 毽撬体K a 毽( x 1 0 9L ／m 0 1 )2莲81 ．1 7 2l 。

1 4 80 ．6 3 40 9 8 5中国医学科学院中国拼和隈科大学硕士研究擞学位论文结果注：抗体分子量以1 5 0 0 0 0 D a 计揍嚣豹綮襄鬻数K a = O 9 8 5 ×1 0 4 L ／m o l 2 ．6 兔抗人c T n I 含成肽多克隆抗体特异性的检测c T n T 、C K 一遗、c T n I 及太c T n I 会藏敦缝藤麓冬获覆毽凝叛，获琢毽渡滚凄均为5 肛g ／r n l ，其中c T n I 合成肷纯品孔为阳性对照孔将纯化的P a A b 以l ：1 0稀释，间接E L I S Ai 去检测抗体效价，酶标仪农4 9 2 n m 处测∞值结果见袭5表5 挠俸特弄毪稔浏纯化的P c A b ( 1 ：1 0 稀释)抗覆包被浓度5 ug ／m lO D , ∞c T n T0 1 3 8C K —M BO ．1 5 6c T n I0 ．8 5 4c T n I 合残簸缝赫1 ．1 2 6空怠对照O 1 2 3掰槛对照0 ．1 4 9由表5 可见，用所合成肽抗朦免疫家兔所获褥数菝体与c T n T 、C K - M B 没毒交叉复应，其反应静∞值几乎接邋本底，丽与人心肌舰钙蛋囱I ( c T n I ) 有良好的反应特性，说明用c T n I 合成肽来制备的抗体具有较好的特弊性。

3 家兔抗盘清豹缝纯及藐蛊涛静鬻自含量静溅定[ 2 “ r l ：3 ．1 本实验选用3 号免疫家兔的血清进行纯化，基于以上的实验基础3 号窳兔血清与天然c T n I 抗原舆商很好盼交义反应由子抗虚清中I g G 的含量较丰窝，其次是t g M ，采蘑辛酸一硫酸蒎方法缝纯疆取的l g ，箕孛大部分为I g G ，约古∞％，少擞为I g i 及I g A 中国医学辩学院中国协和聪科大学硕士研究建学位论文结果3 ．2 鬻紫努吸收法溺定缝健螽豹拣鑫遮蛋塞浓度将纯化艏的抗体样晶稀释2 0 倍麟测得：A ： O ．2 0 3 8矗∞一0 ，2 3 4 9其中A ∞ 1 ．1 5 3 9 5 p g ／c m 2 ，本实验中对于0 ．0 5c m 2膜面积选定包被抗体的量为5 —7 “g ，达到最适吸附蛋白量使检测线、质控线最为清晰7 ．胶体金免疫层析试纸条质量鉴定7 ．1 检测结果判断按该试纸条的检测操作方法，在室温条件下( 1 5 —3 0 ℃) ，检测以正常人阴性血清配制的c T n l 合成肽纯品标准溶液，上样1 0 - - 1 5 r a i n ，5 n g ／m l 的c T n l 合成肽纯品即可被检出，5 n g ／m l 以下的c T n l 标准品则不出现检测带，即为阴性结果。

因此我们把观察结果的最佳时间定为上样后1 5 m i n 检测灵敏度为5 n g ／m l ，而高c T n l 含量的样品，当其渗过检测区时，即可看见检测线出现，而不必等到1 5 m i n 检测结果可能有三种情形：1 ．在检测区和质控区各出现一条紫红色的条带，表示检测结果为阳性2 ．只在质控区出现一条紫红色的条带，表示检测结果为阴性3 ．在检测区和质控区均无紫红色条带出现，表示检测试纸条失效见图一1 1 操作方法阴性结果阳性结果试纸条失效图11试纸条各种检测结果示意图孛器医学科学院中鞠按和医辩太学硕士研究生学位论文结果7 ．2 检测范围的测定：检测黻正常入阴雠血清配制静c T n l 合成膝纯品标准溶液，5 r i g ／m l 黻- F 的c T n I 合成肽纯黠不能羧检氆，对5 r i g ／m l 到l p ．g ／m lc T n I 会成默纯熙其检测豢豹颜色，呈现肉眼可见的由浅剿深紫红色变化，对浓度> l t x g ／r r dc T n I 样品其检测线颜色肉隈判断无差剐故该试纸条半定麓检溺血清c T n l 盼邋用范围为5 n g ／m l—i 潍／m l ，见黧1 2 、1 3 。

7 3 特异性的检测在检测样本中加入几种相关的骚白质c T n T 、C K - M B 对检测结果秃交叉反应4 爱痰漫凌豹测宠：在4 “ C 条件下操作，上样后t 5 m i n 观察结果，5 n g ，m lc T n I 标准鼎的检测线不出现，将观察时间延长至Ⅱ2 0 m i n ，检测线才出现，故4 ℃条件下操作，应在上撵瘫2 0 m i n 薅躐察绩鬃7 ．5 保存时阃：3 7 “ C 保存的试纸条第2 、3 、4 和5 天梭测结聚与第l 天检测结果相同，检测线精控隶l 线翡蕨色深浅在歪露范蠢浓获第6 天越，捡溺线藉窳控线靛颜色殇交浅，但仍在。