第三讲技术方法一.ppt

第三讲第三讲 环境生物技术研究方法环境生物技术研究方法环境生物技术环境生物技术Environmental biotechnologyEnvironmental biotechnology( (一一) )第一节第一节 传统微生物分析方法传统微生物分析方法主要内容主要内容第二节第二节 现代微生物分析方法现代微生物分析方法第一节第一节 传统微生物分析方法传统微生物分析方法一一. 显微直接计数法显微直接计数法Ø 利用血球计数板在显微镜下直接利用血球计数板在显微镜下直接测定观察一定容积中微生物个体测定观察一定容积中微生物个体数目，然后推算出含菌数（包括死数目，然后推算出含菌数（包括死活细胞、微小杂物）活细胞、微小杂物）Ø 结果往往偏高常用于形态个体结果往往偏高常用于形态个体较大的菌体或孢子较大的菌体或孢子1mm1mm二二. 平板计数法平板计数法Ø 目的目的想知道待检测样品中的微生物数量想知道待检测样品中的微生物数量Ø 原理原理根据微生物在固体培养基上所形成的单个菌落，根据微生物在固体培养基上所形成的单个菌落，即是由一个单细胞繁殖而成这一培养特征设计的即是由一个单细胞繁殖而成这一培养特征设计的计数方法，即一个菌落代表一个单细胞。

计数方法，即一个菌落代表一个单细胞菌落总数：菌落总数：指在一定条件下（如需氧情况、营养条指在一定条件下（如需氧情况、营养条件、件、pH、培养温度和时间等）每克（每毫升）检样、培养温度和时间等）每克（每毫升）检样所生长出来的微生物菌落总数所生长出来的微生物菌落总数菌落总数菌落总数并不表示实际中的所有微生物并不表示实际中的所有微生物总数总数，菌落，菌落总数并不能区分其中微生物的种类，所以有时被称总数并不能区分其中微生物的种类，所以有时被称为杂菌数为杂菌数Ø 操作程序操作程序首先将待测样品制成均匀的一系列不同稀释液，首先将待测样品制成均匀的一系列不同稀释液，并尽量使样品中的微生物细胞分散开来，使成单并尽量使样品中的微生物细胞分散开来，使成单个细胞存在，再取一定稀释度、一定量的稀释液个细胞存在，再取一定稀释度、一定量的稀释液接种到平板中，使其均匀分布于平板中的培养基接种到平板中，使其均匀分布于平板中的培养基内经过培养后，由单个细胞生长繁殖形成菌落，内经过培养后，由单个细胞生长繁殖形成菌落，统计菌落数目，即可计算出样品中的含菌数统计菌落数目，即可计算出样品中的含菌数• 平板倾注法平板倾注法     先把适量稀释液先把适量稀释液(1mL)移进灭菌培养品，再倒入已融化并冷移进灭菌培养品，再倒入已融化并冷却至却至45～～5050℃℃的培养基，轻轻转动平板，使稀释液与培养基混的培养基，轻轻转动平板，使稀释液与培养基混合均匀，冷凝后倒置，适温培养。

合均匀，冷凝后倒置，适温培养• 平板表面涂布法平板表面涂布法 先将融化的培养基凝固，再移入适量稀释液（先将融化的培养基凝固，再移入适量稀释液（0.2mL），然后），然后用涂布刀涂布于整个平板的表面，放置片刻用涂布刀涂布于整个平板的表面，放置片刻(约约l0min)，将平，将平板翻转板翻转,适温培养适温培养Ø 操作方法操作方法• 平板表面点滴法平板表面点滴法与涂布法相似，用标定好的微量吸管或注射器针头按滴与涂布法相似，用标定好的微量吸管或注射器针头按滴(使使每滴相当于每滴相当于0．．025mL)将检样稀释液滴加于琼脂平板上固定将检样稀释液滴加于琼脂平板上固定的区域的区域(预先在平板背面用标记笔划成四个区域预先在平板背面用标记笔划成四个区域)，每个区域，每个区域滴滴1滴，每个稀释度滴两个区域，作为平行试验滴加后，滴，每个稀释度滴两个区域，作为平行试验滴加后，将平板放平片刻将平板放平片刻(约约5～～10min)，然后翻转平板，，然后翻转平板，适温培养适温培养主要工具主要工具细菌细菌:牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏：牛肉膏： 3g                     水：水：1000ml蛋白胨：蛋白胨：5g                       琼脂：琼脂：18gpH：：7.0-7.2放线菌放线菌:改良高氏改良高氏1号培养基号培养基KNO3：：1.0g                     水：水：1000mlK2HPO4：：0.5g                 淀粉：淀粉：20gMgSO4·7H2O：：0.5g         NaCl：：0.5gFeSO4 ·7H2O：：0.5g         琼脂：琼脂：18g真菌真菌:马丁培养基马丁培养基KH2PO4：：1.0g                 葡萄糖：葡萄糖：10gMgSO4·7H2O：：0.5g         NaCl：：0.5g琼脂：琼脂：18g                         水：水：1000ml3.3ml 1%孟加拉红孟加拉红/1000ml0.3ml 1% 链霉素链霉素/100ml通常情况下的稀释度通常情况下的稀释度细菌：细菌：10-4~10-6真菌：真菌：10-1 ~ 10-3放线菌：放线菌：10-3 ~ 10-5培养：培养：28 ~30 ℃℃细菌：细菌：3 ~5d真菌：真菌：5 ~7d放线菌：放线菌：10 ~ 14d2 ~3d3 ~5d5 ~7d20 ~20010-10020-200Ø 注意事项注意事项（（1））样品稀释样品稀释时时尽量使样品中的微生物细胞分散开，尽量使样品中的微生物细胞分散开，以以单个细胞存在（否则一个菌落就不只是代表一个细单个细胞存在（否则一个菌落就不只是代表一个细胞）胞）（（2）接种量要准确）接种量要准确（（3）涂布要均匀）涂布要均匀Ø 使用范围使用范围一般用于土壤、水源一般用于土壤、水源、大气、食品等、大气、食品等的污染程度检验的污染程度检验三三. 最大或然数法（最大或然数法（MPN））Ø 目的目的     计数待测样品中的特殊功能微生物数量；检测计数待测样品中的特殊功能微生物数量；检测样品中特殊微生物功能是否存在样品中特殊微生物功能是否存在最大或然数最大或然数(most probable number，，MPN) 计数又计数又称稀释培养计数，适用于测定在一个混杂的微生物称稀释培养计数，适用于测定在一个混杂的微生物群落中虽不占优势，但却具有特殊生理功能的类群。

群落中虽不占优势，但却具有特殊生理功能的类群其特点是利用待测微生物的特殊生理功能的选择性其特点是利用待测微生物的特殊生理功能的选择性来摆脱其他微生物类群的干扰，并通过该生理功能来摆脱其他微生物类群的干扰，并通过该生理功能的表现来判断该类群微生物的存在和丰度的表现来判断该类群微生物的存在和丰度Ø 原理原理将待测样品作一系列稀释，一直稀释到将少量将待测样品作一系列稀释，一直稀释到将少量（如（如lmL）的稀释液接种到新鲜培养基中没有或极）的稀释液接种到新鲜培养基中没有或极少出现生长繁殖根据没有生长的最低稀释度与少出现生长繁殖根据没有生长的最低稀释度与出现生长的最高稀释度，采用出现生长的最高稀释度，采用“最大或然数最大或然数”理理论，可以计算出样品单位体积中细菌数的近似值论，可以计算出样品单位体积中细菌数的近似值.Ø 操作程序操作程序10-210-310-410-510-61ml9ml稀释度稀释度10-110-210-310-410-5生长情况生长情况5555555420542举例举例重复管数重复管数54410-110-210-310-410-554220稀释度稀释度生长情况生长情况 数量指数量指标标细菌近细菌近似值似值数量指数量指标标数量指数量指标标数量指数量指标标数量指数量指标标0000.01011302125430010.21021312205440100.41031402215450110.21102002225500120.61112012305510200.41122022315520210.61202032405530300.61212103005541000.2122211301555五次重复测数统计表五次重复测数统计表结果计算：结果计算：每个干土中菌数每个干土中菌数=              近似值近似值数量指标第一位数稀释倍数数量指标第一位数稀释倍数                                   干土干土%Ø 适用于测定在一个混杂的微生物群落中虽不占优适用于测定在一个混杂的微生物群落中虽不占优势，但却具有特殊生理功能的类群势，但却具有特殊生理功能的类群Ø 特点是利用待测微生物的特殊生理功能的选择性特点是利用待测微生物的特殊生理功能的选择性来摆脱其他微生物类群的干扰，并通过该生理功能来摆脱其他微生物类群的干扰，并通过该生理功能的表现来判断该类群微生物的存在和丰度的表现来判断该类群微生物的存在和丰度Ø 适合于测定土壤微生物中的特定生理群（如氨化、适合于测定土壤微生物中的特定生理群（如氨化、硝化、纤维素分解、固氮、硫化和反硫化细菌等硝化、纤维素分解、固氮、硫化和反硫化细菌等)注意注意（（1）菌液稀释度要合适。

原则是最低稀释度的所）菌液稀释度要合适原则是最低稀释度的所有重复都应有菌生长，而最高稀释度的所有重复无有重复都应有菌生长，而最高稀释度的所有重复无菌生长2）每个接种稀释度必须有重复，重复次数可根）每个接种稀释度必须有重复，重复次数可根据需要和条件而定，一般据需要和条件而定，一般3—5个重复，但重复次数个重复，但重复次数越多，误差就会越小，相对地说结果就会越正确越多，误差就会越小，相对地说结果就会越正确四四. 微生物生物量碳微生物生物量碳氯仿熏蒸培养法、氯仿熏蒸培养法、氯仿熏蒸浸提法（去乙醇氯仿）氯仿熏蒸浸提法（去乙醇氯仿）原理原理：将土壤经过氯仿熏蒸后，在好气条件下培：将土壤经过氯仿熏蒸后，在好气条件下培养（养（10d），然后测定培养期间），然后测定培养期间CO2的释放量，根的释放量，根据据CO2的增量计算土壤中的微生物生物量碳的增量计算土壤中的微生物生物量碳Ø 培养法培养法• 培养时间过长，不适合快速测定培养时间过长，不适合快速测定• 不适合强酸性土壤的测定不适合强酸性土壤的测定• 不适合风干土不适合风干土• 不适合添加有新鲜有机质的土壤不适合添加有新鲜有机质的土壤缺点缺点原理原理：土壤经氯仿熏蒸处理，微生物被杀死，细：土壤经氯仿熏蒸处理，微生物被杀死，细胞破裂后，细胞内容物释放到土壤中，导致土壤胞破裂后，细胞内容物释放到土壤中，导致土壤中可提取碳、氨基酸、氮、磷和硫等大幅度增加，中可提取碳、氨基酸、氮、磷和硫等大幅度增加，通过测定浸提液中全碳的含量可计算微生物生物通过测定浸提液中全碳的含量可计算微生物生物量碳量碳Ø 浸提法浸提法• 样品立即除去植物残体、土壤动物，土壤太湿需样品立即除去植物残体、土壤动物，土壤太湿需要阴凉处凉干要阴凉处凉干• 抽提真空时防爆；培养过程防漏气；氯仿蒸汽要抽提真空时防爆；培养过程防漏气；氯仿蒸汽要饱和；保持湿度；暗处培养饱和；保持湿度；暗处培养•  提取充分提取充分 注意注意六六. 呼吸法呼吸法   密密闭闭容容器器法法、、华华勃勃检检压压法法、、呼呼吸吸仪仪法法、、基基质质诱导呼吸法（诱导呼吸法（SIR）等）等五五. 微生物酶法微生物酶法   脲酶、磷酸酶、脱氢酶、过氧化氢酶脲酶、磷酸酶、脱氢酶、过氧化氢酶自然样品中可培养的微生物占可数微生物的比例自然样品中可培养的微生物占可数微生物的比例第二节第二节 现代微生物分析方法现代微生物分析方法1. 基于基于PCR反应的微生物分析方法（反应的微生物分析方法（PCR-DGGE））2. 基于生物标记的微生物分析方法（基于生物标记的微生物分析方法（PLFA））3. 基于碳利用方式的微生物分析方法基于碳利用方式的微生物分析方法（（BIOLOG））4. 基于免疫技术的微生物分析方法（基于免疫技术的微生物分析方法（ELISA））5. 基于原位杂交反应的微生物分析方法（基于原位杂交反应的微生物分析方法（FISH））6. 基于稳定同位素探针基于稳定同位素探针-核酸微生物分析技术核酸微生物分析技术（（SIP-DNA, SIP-RNA, SIP-PLFA））PCR介绍介绍 PCR（（Polymerase Chain Reaction））：即聚合：即聚合酶链式反应，是酶链式反应，是2020世纪世纪8080年代中期（年代中期（19851985）发）发展起来的一项展起来的一项体外快速核酸扩增体外快速核酸扩增技术，其基本技术，其基本原理类似于原理类似于DNADNA的天然复制过程。

的天然复制过程　它通过与目的基因两端互补的寡核苷酸引物，　它通过与目的基因两端互补的寡核苷酸引物，经经“变性变性----退火退火----延伸延伸”三个基本反应步骤完三个基本反应步骤完成对靶序列的扩增成对靶序列的扩增1. PCR原理原理   DNA模板在高温下变性，模板在高温下变性，DNA解链成单链，当温解链成单链，当温度降低时，人工合成的两个寡核苷酸引物在合适的度降低时，人工合成的两个寡核苷酸引物在合适的复性温度下分别与目的基因两侧的两条单链互补结复性温度下分别与目的基因两侧的两条单链互补结合，在合，在DNA聚合酶作用下，随着温度的缓慢提升，聚合酶作用下，随着温度的缓慢提升，引物逐渐延伸，两条引物之间的区域被合成，完成引物逐渐延伸，两条引物之间的区域被合成，完成一个循环，然后一个循环，然后DNA再次被变性，进入下一个循环再次被变性，进入下一个循环 凝胶成像系统凝胶成像系统凝胶成像系统凝胶成像系统2. PCR的反应流程的反应流程预变性：预变性：             94℃ 94℃ ，，2min;2min;P1P2退火退火延伸延伸变性变性P1P2P1P230-35Cycles94℃，，30sTm-5℃，，30s72℃，，1-2kb/min循环循环补 充 延 伸 ： 72℃ ， 5-10min.5’3’3’5’5’3’3’5’3’5’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’3’5’3’5’3’5’5’3’5’3’5’3’5’3’3’5’5’3’3’5’ 5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’3’5’3’5’特异性强:可以从成千上万个基因中对某个特定基因进行可以从成千上万个基因中对某个特定基因进行扩增。

扩增高效快速:可可将将所所要要研研究究的的目目的的基基因因或或某某一一DNADNA片片段段于于数数小时内扩增至百万倍以上小时内扩增至百万倍以上, ,使肉眼能直接观察和判断使肉眼能直接观察和判断灵敏度高:可可以以从从微微量量的的样样品品中中扩扩增增出出足足量量的的DNADNA供供分分析研究和检测鉴定析研究和检测鉴定重复性好:在在体体系系稳稳定定的的情情况况下下，，对对某某个个特特定定基基因因的的扩扩增不会受时空和操作主体变化的影响增不会受时空和操作主体变化的影响易自动化:只只要要编编写写一一个个程程序序，，仪仪器器就就可可自自动动完完成成整整个个扩增过程扩增过程3. PCR的特点的特点4. PCR的反应体系的反应体系• 模板模板• 引物引物• 耐热聚合酶耐热聚合酶• dNTP• 二价阳离子二价阳离子• 反应缓冲液反应缓冲液• 水水一一. 模板模板• 模板可以是模板可以是DNADNA，也可以是，也可以是RNARNA 当用当用RNARNA做模板时，先经过反转录生成做模板时，先经过反转录生成cDNA cDNA Ø 现在用的现在用的PCRPCR酶都仅识别酶都仅识别DNADNA，不能识别，不能识别RNARNAØ 扩增是成对扩增扩增是成对扩增Ø RNA RNA易降解，易降解，RNARNA酶存在广泛，活性稳定酶存在广泛，活性稳定• 选择选择16S rRNA的原因的原因 o 核糖体核糖体rRNArRNA的保守性和可变性的保守性和可变性o 长度和信息量适中长度和信息量适中(50(50个功能域个功能域) )o 有重要的功能（蛋白质合成开始有关）有重要的功能（蛋白质合成开始有关）o 有比较完善的有比较完善的16S rRNA16S rRNA数据库数据库 • 用的最多的是原核生物的核糖体用的最多的是原核生物的核糖体16S rRNA 16S rRNA rDNA rDNA 和和rRNArRNA中的中的r r””是是ribosome(ribosome(核糖体核糖体) )的缩写。

的缩写rDNArDNA指的是基因组中编码核糖体指的是基因组中编码核糖体RNARNA（（rRNArRNA）分子的）分子的对应的对应的DNADNA序列，也就是编码序列，也就是编码16S rRNA16S rRNA的基因rRNArRNA指的是指的是rDNArDNA的转录产物，它是构成核糖体的重的转录产物，它是构成核糖体的重要成分，核糖体由许多小的要成分，核糖体由许多小的rRNArRNA分子组装而成，分子组装而成，16S 16S rRNArRNA是其中一个组件是其中一个组件. .一般所分析的对象都是一般所分析的对象都是16S rDNA16S rDNA，因为，因为DNADNA提取容易，提取容易，也比较稳定也比较稳定•16S rDNA与与16S rRNA的区别的区别 • 提取提取 利用利用DNADNA和蛋白质对提取过程中各种试剂不同的反和蛋白质对提取过程中各种试剂不同的反应和溶解性来达到分离目的应和溶解性来达到分离目的 o 方法方法 细胞提取法细胞提取法：：DNADNA纯度较高，但提取效率较低，操纯度较高，但提取效率较低，操作烦琐作烦琐直接溶解法直接溶解法：操作简单，效率高，但获得的：操作简单，效率高，但获得的DNADNA纯纯度不够，需要进行纯化处理度不够，需要进行纯化处理 o 原理原理 物理法物理法：玻璃珠匀浆法、超声震荡法、反复冻溶：玻璃珠匀浆法、超声震荡法、反复冻溶法、研磨法法、研磨法化学法化学法：表面活性剂（：表面活性剂（SDSSDS））生物法生物法：酶解：酶解 • 细胞破碎细胞破碎物理法物理法：：DNADNA分子断裂分子断裂化学法化学法：对细胞壁厚的细菌比较困难：对细胞壁厚的细菌比较困难常用：酶解常用：酶解+SDS+SDS Ø 利用苯酚是蛋白质的变性剂，反复抽提，使蛋利用苯酚是蛋白质的变性剂，反复抽提，使蛋白质变性白质变性Ø 氯仿加速有机相与水相分离氯仿加速有机相与水相分离Ø SDS SDS将细胞膜裂解，在蛋白酶将细胞膜裂解，在蛋白酶K K的作用下消化蛋的作用下消化蛋白质或多肽或小肽分子，核酸蛋白质变性降解，白质或多肽或小肽分子，核酸蛋白质变性降解，使使DNADNA从核蛋白中游离出来从核蛋白中游离出来 Ø异戊醇异戊醇作用是消除抽提过程中产生的泡沫作用是消除抽提过程中产生的泡沫 • 经典提取方法（苯酚经典提取方法（苯酚/氯仿有机提取法）氯仿有机提取法）为什么土壤样品需要纯化模板？为什么土壤样品需要纯化模板？• 有机质（如腐殖质）有机质（如腐殖质）• 重金属重金属纯化方法纯化方法• 商业化的核酸纯化试剂盒商业化的核酸纯化试剂盒 • 传统方法（乙醇传统方法（乙醇- -醋酸钠）醋酸钠）注意！！！注意！！！纯纯 度：度：杂蛋白、多糖、酚类杂蛋白、多糖、酚类复杂性：复杂性：质粒、原核基因组质粒、原核基因组DNADNA、真核基、真核基 因组因组DNADNA完整性：完整性：降解降解污污 染：染：有扩增产物的污染有扩增产物的污染    数数 量：量：适中适中二二. 引物引物 引物是引物是PCR特异性反应的关键，特异性反应的关键，PCR反应的特异性取决于引物与模板反应的特异性取决于引物与模板DNA的互的互补程度。

补程度 Ø 了解要扩增片段的了解要扩增片段的DNA序列序列Ø 找到找到DNA序列的保守区并具有特异性（非特异扩增序列的保守区并具有特异性（非特异扩增区序列的同源性小于区序列的同源性小于70%Ø 避开能形成二级结构的区域避开能形成二级结构的区域引物设计引物设计①①①①   引物长度引物长度引物长度引物长度:  10:  10～～～～30 bp30 bp        过短：特异性差过短：特异性差过短：特异性差过短：特异性差            过过过过长长长长：：：：导导导导致致致致延延延延伸伸伸伸温温温温度度度度大大大大于于于于7474℃℃，，，，不不不不适适适适于于于于TaqTaq   DNA DNA 聚聚聚聚合酶进行反应（大于合酶进行反应（大于合酶进行反应（大于合酶进行反应（大于38bp38bp））））②②②②   碱基分布碱基分布碱基分布碱基分布: A: A、、、、T T、、、、GG、、、、C C 随机分布随机分布随机分布随机分布• 引物的设计原则引物的设计原则   ③③③③   G+CG+C含含含含量量量量：：：：4040   % % ～～～～60%60%，，，，过过过过高高高高或或或或过过过过低低低低都都都都不不不不利利利利于于于于引引引引发发发发反反反反应应应应。

有有有有效效效效引引引引物物物物的的的的TmTm为为为为55~80℃55~80℃，，，，TmTm最最最最好好好好在在在在7272   ℃℃左右左右左右左右④④④④   引物间引物间：不能有连续：不能有连续4个碱基互补个碱基互补⑦⑦⑦⑦引物引物5′末端碱基末端碱基:可不与模板可不与模板DNA互补，可做修饰，互补，可做修饰，但但3 ′不可修饰，不可修饰，因为引物的延伸是从因为引物的延伸是从3′端开始的端开始的⑥⑥⑥⑥   引物引物3′末端碱基末端碱基：最好选：最好选T，不选，不选A，为，为A时即使时即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而为在错配的情况下，也能有引发链的合成，而为T时时错配的引发效率大大降低；出现错配的引发效率大大降低；出现3 个以上的连续碱个以上的连续碱基，如基，如GGG 或或CCC，也会使错误引发机率增加，也会使错误引发机率增加⑤⑤⑤⑤   引物自身引物自身：不应形成二级结构：不应形成二级结构(互补碱基小于互补碱基小于3bp)• 引物的使用引物的使用引物的浓度一般要求在引物的浓度一般要求在0.20.2～～0.50.5µmol/L mol/L 低于低于0.2 0.2 µ mol/L mol/L: : 产量下降产量下降高于高于0.5 0.5 µ mol/l: mol/l: 促使错误引导及非特异性产物促使错误引导及非特异性产物积累积累; ; 易形成二聚体易形成二聚体; ;这些会与靶序列竞争这些会与靶序列竞争DNADNA聚聚合酶和合酶和dNTPsdNTPs 一般用一般用TETE配制成高浓度母液（配制成高浓度母液（1010µmol/Lmol/L），保），保存在－存在－ 20℃20℃，使用前用，使用前用ddHddH2 2O O稀释成工作液。

避稀释成工作液避免反复冻融，造成引物降解冻干引物－免反复冻融，造成引物降解冻干引物－ 20℃20℃下下可保存可保存12~2412~24个月，液体状态可以保存个月，液体状态可以保存6 6个月个月 引物引物1引物引物2注意！！！注意！！！纯纯 度：度：混有短片段引物（纯化）混有短片段引物（纯化）完整性：完整性：避免反复冻融避免反复冻融污污 染：染：模板模板DNADNA三三. 耐热聚合酶耐热聚合酶• 耐热聚合酶的选择非常重要，很大程度上耐热聚合酶的选择非常重要，很大程度上关系到扩增的效率和特异性关系到扩增的效率和特异性• 1983 1983年，美国年，美国PE-CetusPE-Cetus公司使用大肠杆菌公司使用大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶I I的的KlenowKlenow片段（片段（37℃37℃））• 19871987年，发现耐热性年，发现耐热性DNADNA聚合酶聚合酶Taq Taq polpol后，后，PCRPCR反应特异性得到提高反应特异性得到提高  Taq Taqpolpol、、PfuPfu、、HotStart HotStart TaqTaq、、TaqTaq Plus Plus、、Long Long TaqTaq，其中使用较多的是，其中使用较多的是Taq Taq DNADNA聚合酶聚合酶 主要耐热酶主要耐热酶•TapTap pol pol分离自美国黄石国家公园温泉中嗜热水生菌分离自美国黄石国家公园温泉中嗜热水生菌• Taq Taq pol pol 酶有较强的稳定性，在酶有较强的稳定性，在92.592.5、、9595、、97.5℃97.5℃时的半衰期分别为时的半衰期分别为130130、、4040、、5 5～～6min6min•Taq Taq pol pol 酶有较高的催化活性，在所有的耐热酶有较高的催化活性，在所有的耐热DNADNA聚聚合酶中，催化活性最高，达合酶中，催化活性最高，达2 2××10105 5 U/mg U/mg•最适催化温度为最适催化温度为7575～～80℃80℃，延伸速率约为，延伸速率约为150150～～300300个个核苷酸核苷酸/ /（秒（秒·酶分子）酶分子）（（1 1）需要提供合成模板）需要提供合成模板（（2 2）不能起始新的）不能起始新的DNADNA链，必须要有引物提供链，必须要有引物提供3'3'－－OHOH（（3 3）合成的方向都是）合成的方向都是5 ' →3 '5 ' →3 '（（4 4）除聚合）除聚合DNADNA外还有其它功能。

外还有其它功能DNA的聚合酶特点的聚合酶特点注意！！！注意！！！纯纯 度度: :宿主菌宿主菌DNADNA污染、宿主蛋白污染、宿主蛋白酶酶 量量：：适适量量（（2.5U/100ul2.5U/100ul）），，过过高高，，非特异性扩增；过低，合成产物量少非特异性扩增；过低，合成产物量少反应缓冲液：反应缓冲液：匹配匹配不同不同DNA聚合酶聚合酶PCR-DGGE结果结果成分成分: :Tris-HCl、、K＋＋、、增强剂、稳定剂增强剂、稳定剂（（Mg2+））(三羟甲基氨基甲烷三羟甲基氨基甲烷 )浓度浓度四四. 反应缓冲液反应缓冲液10mmol/L  pH 8.3（（25 ℃ ））优点：优点： ①①Tris碱的碱性较强，所以可以只用这一种碱的碱性较强，所以可以只用这一种缓冲体系配制缓冲体系配制pH范围由酸性到碱性的大范围范围由酸性到碱性的大范围pH值的值的缓冲液；缓冲液；②②对生物化学过程干扰很小，不与钙、镁对生物化学过程干扰很小，不与钙、镁离子及重金属离子发生沉淀离子及重金属离子发生沉淀 为什么使用为什么使用Tris-HCl缓冲液缓冲液缺点：缺点：①①缓冲液的缓冲液的pH值受溶液浓度影响较大，缓冲值受溶液浓度影响较大，缓冲液稀释液稀释10倍，倍，pH值的变化大于值的变化大于0.1；；②②温度效应大，温度效应大，温度变化对缓冲液温度变化对缓冲液pH值的影响很大（值的影响很大（4℃时时8.4，，37℃时时7.4），一定要在使用温度下进行配制；），一定要在使用温度下进行配制；③③易吸收空气中的易吸收空气中的CO2，配制的缓冲液要盖严密封；，配制的缓冲液要盖严密封； ④④对某些对某些pH电极发生一定的干扰作用，所以要使电极发生一定的干扰作用，所以要使用与用与Tris溶液具有兼容性的电极。

溶液具有兼容性的电极五五. 二价阳离子二价阳离子• Mg2+是是PCR反应的稳定剂，是耐热聚合酶的重反应的稳定剂，是耐热聚合酶的重要影响因子，对要影响因子，对PCR产物的特异性及产量有显著产物的特异性及产量有显著影响影响• Mg2+浓度过低，会降低浓度过低，会降低Taq DNA酶的活性，产物酶的活性，产物下降；下降；Mg2+浓度过高，会使反应特异性降低浓度过高，会使反应特异性降低 Mg2+浓度浓度1.5～～2.0mmol/L为宜，因为为宜，因为DNA模板、模板、引物和引物和dNTP均可与均可与Mg2+结合结合 六六. dNTP• dNTP dNTP是是PCRPCR反应的原料，其浓度与质量和反应的原料，其浓度与质量和PCRPCR反应反应效率有密切关系效率有密切关系•dNTPdNTP使用浓度过高易产生错误掺入，或得不到扩使用浓度过高易产生错误掺入，或得不到扩增产物，过高增产物，过高dNTPdNTP浓度还可能导致浓度还可能导致MgMg2+2+浓度下降浓度下降• 使用浓度过低，使用浓度过低，PCRPCR产物下降产物下降 • 一般常用一般常用dNTPdNTP终浓度以终浓度以5050～～200200µmol/Lmol/L为宜为宜• 四种脱氧核苷酸的浓度应相同，如果其中一种四种脱氧核苷酸的浓度应相同，如果其中一种dNTPdNTP偏高或偏低，会诱发聚合酶的错误掺入作用，偏高或偏低，会诱发聚合酶的错误掺入作用，降低合成速度，过早终止延伸反应降低合成速度，过早终止延伸反应 • 避免反复冻溶（易降解）避免反复冻溶（易降解）• 最好用最好用bufferbuffer溶解溶解pH: pH: PCRPCR反应所需的反应所需的pHpH通常在通常在8.0~9.08.0~9.0之间之间污染：污染：DNADNA污染污染　　　　　　　　　　　　　　七七. 水水5. PCR产物检测产物检测 PCR反应后期扩增产物已不再呈指数方式增加，而趋于一条平线，如果继续扩增，将会出现大量非特异性的产物，这就是所谓的平台效应• dNTP、酶、引物、镁离子浓度下降• 聚合酶酶活在数次高温后活性下降• 产物浓度过高影响PCR反应原因原因• 凝胶电泳法凝胶电泳法• 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR技术技术定性及定量方法定性及定量方法大片段分子量大，在电泳速度慢，而小片段则大片段分子量大，在电泳速度慢，而小片段则相反，迁移速率快。

根据凝胶电泳中条带的位相反，迁移速率快根据凝胶电泳中条带的位置，可以判断置，可以判断PCRPCR扩增产物的大小扩增产物的大小1）凝胶电泳法）凝胶电泳法种类种类琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是实验室最常用的是实验室最常用的PCRPCR检测方法，操检测方法，操作简便，仅需要少量的扩增产物即可进行检测，范作简便，仅需要少量的扩增产物即可进行检测，范围围100100～～10000bp10000bp，精度稍差，精度稍差聚丙烯酰胺凝胶电泳：聚丙烯酰胺凝胶电泳： ① ①分辨率高，长度仅差分辨率高，长度仅差0.2%0.2%的的DNADNA分子即可被分开；分子即可被分开；②②能够装载能够装载DNADNA的量远大于的量远大于琼脂糖凝胶电泳；琼脂糖凝胶电泳；③③从凝胶中回收的从凝胶中回收的DNADNA纯度高纯度高 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳n 溴化乙锭溴化乙锭(EB)(EB)是一种荧光染料，是一种荧光染料，EBEB分子可嵌入核分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光根据情况可在凝胶电泳液中加入终浓度为光。

根据情况可在凝胶电泳液中加入终浓度为 0.50.5µg/mlg/ml的的EBEB（迁移率降低近（迁移率降低近15%15%），亦可在电泳后，），亦可在电泳后，将凝胶浸入该浓度的溶液中染色将凝胶浸入该浓度的溶液中染色1010～～15min15min染色观察染色观察• EB EB见光分解见光分解• EB-DNA EB-DNA 的的EBEB发出的荧光发出的荧光比游离的凝胶中的比游离的凝胶中的EBEB荧光强荧光强度大度大1010倍，无需洗背景倍，无需洗背景•可诱发突变可诱发突变, ,具有潜在致癌具有潜在致癌性性, ,且具有中等毒性且具有中等毒性• EB EB替代品替代品GoldView(GV)GoldView(GV)是一种可代替溴化乙锭（是一种可代替溴化乙锭（EBEB）的新型核）的新型核酸染料，灵敏度与酸染料，灵敏度与EBEB相当，使用方法与之完全相同，相当，使用方法与之完全相同，在在100ml100ml琼脂糖胶溶液中加入琼脂糖胶溶液中加入5 5μμl GoldViewl GoldView™ ™即可在紫外透射光下双链在紫外透射光下双链DNADNA呈现绿色荧光，也可用于染呈现绿色荧光，也可用于染RNARNA。

荧光颜料：荧光颜料： GeneFinderGeneFinder™ ™、、SYBR GreenSYBR Green、、GelstarGelstar、、SYPRO OrangeSYPRO Orange、荧光素、绿色荧光蛋白等、荧光素、绿色荧光蛋白等n 银染色银染色: :银染色液中的银离子银染色液中的银离子(Ag(Ag+ +) )可与核酸形成稳可与核酸形成稳定的复合物，然后用还原剂（如甲醛）使定的复合物，然后用还原剂（如甲醛）使AgAg+ +还原成还原成银颗粒，可把核酸电泳带染色黑褐色主要用于聚丙银颗粒，可把核酸电泳带染色黑褐色主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色，也用于琼脂糖凝胶染色其灵烯酰胺凝胶电泳染色，也用于琼脂糖凝胶染色其灵敏度比敏度比EBEB高高200200倍但银染色后，倍但银染色后，DNADNA不宜回收不宜回收Agarose Gel Electrophoresis（（2）实时荧光定量）实时荧光定量PCR技术技术                                   (Real-time Quantitative PCR)        在在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

对未知模板进行定量分析的方法扩增曲线图：扩增曲线图： 横坐标：横坐标：扩增循环数（扩增循环数（CycleCycle）） 纵坐标：纵坐标：荧光强度荧光强度 每个循环进行一次荧光信号的收集每个循环进行一次荧光信号的收集荧光荧光基团基团荧光检测元件荧光检测元件实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理---- ---- 扩增曲线扩增曲线实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理荧光信号的域值（荧光信号的域值（threshold threshold ））荧光本底信号（baseline） CT值• 背景信号阶段背景信号阶段 •  信号指数扩增阶段信号指数扩增阶段• 平台期平台期 基线范围:从第3个循环起到CT值前3个循环止，其终点要根据每次实验的具体数据调整，一般取第3～15个循环之间早于3个循环时，荧光信号很弱，扣除背景后的校正信号往往波动比较大，不是真正的基线高度；而在CT值前3个循环之内，大多数情况下荧光信号已经开始增强，超过了基线高度，都不宜当作基线来处理阈值:基线范围内荧光信号强度标准偏差的10倍基线:在PCR反应最初循环里，荧光信号变化不大，接近一条直线C CT T值：值：§ 是PCR扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数§ 基线上方产生可检测到的统计学上显著的荧光发射时所对应的PCR循环次数§CT值则极具重现性 CT值取决于阈值，阈值取决于基线，基线取决于实验的质量实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理---- ---- 荧光定量原理荧光定量原理q 模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即CT值越小q LogDNA浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品CT值，就可以计算出样品中所含的模板量实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理----- DNA ----- DNA 产物的荧光标记产物的荧光标记非特异性荧光标记：非特异性荧光标记： 1 1、、 SYBR GreenSYBR Green 特异性荧光标记：特异性荧光标记： 2 2、、TaqManTaqMan 3 3、、Molecular BeaconMolecular Beacon 4 4、、AmplisensorAmplisensorRSYBR Green法----工作机理q SYBR Green SYBR Green 能结合到双链能结合到双链DNADNA的小沟部位的小沟部位q SYBR Green SYBR Green 只有和双链只有和双链DNADNA结合后才发荧光结合后才发荧光q 变性时，变性时，DNADNA双链分开，无荧光双链分开，无荧光q 复性和延伸时，形成双链复性和延伸时，形成双链DNADNA，， SYBR Green SYBR Green 发荧发荧光，在此阶段收集荧光。

光，在此阶段收集荧光q模板：模板：6 6个样品个样品, , 只改变只改变SYBR GreenSYBR Green浓度浓度qSYBR GreenSYBR Green浓度：浓度：3 3个浓度个浓度C1C1 C2C2 C3C3C2C1C3SYBR Green SYBR Green 法法----------优缺点优缺点 q 对对DNADNA模板没有选择性模板没有选择性 --------适用于任何适用于任何DNADNAq 使用方便使用方便 ----------不必设计复杂探针不必设计复杂探针q 非常灵敏非常灵敏q 便宜便宜优优 点点q 容易与非特异性双链容易与非特异性双链DNADNA结合，产生假阳性（引物二结合，产生假阳性（引物二聚体、单链二聚体、错配），聚体、单链二聚体、错配），但可以通过融解曲线的分析，但可以通过融解曲线的分析，优化反应条件优化反应条件q 对引物特异性要求较高对引物特异性要求较高缺缺 点点实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 方法方法2 -------TaqMan2 -------TaqMan法法与目标序列互补与目标序列互补TaqMan---TaqMan---水解型杂交探针水解型杂交探针v 5′ 5′端标记有报告基团端标记有报告基团(Reporter, R) (Reporter, R) ，如，如FAMFAM、、VICVIC等等 v 3′3′端标记有荧光淬灭基团端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q)(Quencher, Q)v 探针完整，探针完整，R R所发射的荧光能量被所发射的荧光能量被Q Q基团吸收基团吸收 ，无荧光，，无荧光， R R与与Q Q分开，发荧光分开，发荧光v TaqDNATaqDNA聚合酶有聚合酶有 5′→3′5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针外切核酸酶活性，可水解探针TaqManTaqMan法法----------工作原理工作原理每扩增一条每扩增一条DNADNA分子，释放一个荧光信号，可分子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光以在循环过程中任一点检测荧光RQ5’3’5’3’ExcitationRQ QRQRExcitation双标记探针（双标记探针（Taqman Probe））5′TaqManTaqMan法法----------优缺点优缺点q 对目标序列的高特异性对目标序列的高特异性 ------------阴性结果确定阴性结果确定q 设计相对简单设计相对简单 ------------与目标序列某与目标序列某一区域互补一区域互补q重复性比较好重复性比较好优优 点点q 只适合一个特定的目标q 委托公司标记，价格较高q 不易找到本底低的探针缺 点6. PCR常见问题常见问题• 无扩增产物无扩增产物• 非特意性扩增非特意性扩增• 拖尾拖尾 • 假阳性假阳性问题一问题一 无扩增产物无扩增产物 现象现象：：正对照有条带，而样品则无正对照有条带，而样品则无1.1.模板模板: :含有抑制物，含量含有抑制物，含量低低2.2.该该BufferBuffer对样品不合适对样品不合适3.3.引物设计不当或者发生引物设计不当或者发生降解降解4.4.反应条件：退火温度太反应条件：退火温度太高，延伸时间太短高，延伸时间太短对对策策1.1.纯化模板或者使用试剂纯化模板或者使用试剂盒提取模板盒提取模板DNADNA2.2.更换更换BufferBuffer或调整浓度或调整浓度3.3.重新设计引物（避免链重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物构）或者换一管新引物4.4.降低退火温度、延长延降低退火温度、延长延伸时间伸时间可能原因可能原因问题二问题二 非特异性扩增非特异性扩增现现象象：：PCRPCR扩扩增增后后出出现现的的条条带带与与预预计计的的大大小小不不一一致致，，或或大大或或小小，，或或者者同同时时出出现现特特异异性性扩扩增增带带与与非非特异性扩增带。

特异性扩增带1.1.引物特异性差引物特异性差2.2.酶纯度不高酶纯度不高3.3.MgMg2+2+浓度偏高浓度偏高4.4.退火温度偏低退火温度偏低5.5.BufferBuffer不合适不合适6.6.循环次数过多循环次数过多对对策策1.1.重新设计引物或者使重新设计引物或者使用巢式用巢式PCRPCR2.2.换用高纯度的酶换用高纯度的酶3.3.降低镁离子浓度降低镁离子浓度4.4.适当提高退火温度或适当提高退火温度或使用二阶段温度法使用二阶段温度法5.5.更换更换BufferBuffer6.6.减少循环次数减少循环次数 可能原因可能原因问题三问题三 拖尾拖尾 现象现象：产物在凝胶上呈：产物在凝胶上呈SmearSmear状态状态 1.1.酶量过多酶量过多2.2.模板不纯模板不纯3.3.循环次数过多循环次数过多4.4.dNTPdNTP、、MgMg2+2+浓度偏高浓度偏高5.5.退火温度偏低退火温度偏低6.6.BufferBuffer不合适不合适对对策策1.1.适量用酶适量用酶2.2.纯化模板纯化模板3.3.减少循环次数减少循环次数4.4.适当降低适当降低dNTPdNTP和和镁离镁离子子的浓度的浓度5.5.适当提高退火温度适当提高退火温度6.6.更换更换BufferBuffer可能原因可能原因问题四问题四 假阳性假阳性现象现象：：空白对照出现目的扩增产物空白对照出现目的扩增产物靶序列或扩增产物的交靶序列或扩增产物的交叉污染叉污染对对策策1.1.操作时应小心轻柔，防止将靶操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心序列吸入加样枪内或溅出离心管外管外2.2.除除酶酶及及不不能能耐耐高高温温的的物物质质外外，，所所有有试试剂剂或或器器材材均均应应高高压压消消毒毒。

所所用用离离心心管管及及样样进进枪枪头头等等均均应应一次性使用一次性使用3.3.各各种种试试剂剂最最好好先先进进行行分分装装，，然然后低温贮存后低温贮存7. 注意事项注意事项• 合理分隔实验室（标本处理、PCR反应液制备、PCR循环扩增、 PCR产物鉴定区）• 实验前应将实验室用紫外线消毒以破坏残留的DNA或RNA • 配制PCR反应的移液器和其它移液器分开使用经常更换手套防止来自表皮的细胞污染• 吸样时尽量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或产生气溶胶污染8. 提高提高PCR反应特异性的策略反应特异性的策略策略一：巢式策略一：巢式PCRPCR（（Nest-PCRNest-PCR））Ø 两套引物，扩增两次两套引物，扩增两次Ø 两套引物的两套引物的T Tm m值和浓度均不相同，外部引物的值和浓度均不相同，外部引物的T Tm m值比内部引物的高，而外部引物的浓度往往比内值比内部引物的高，而外部引物的浓度往往比内部引物的低部引物的低Ø 巢式巢式PCRPCR可以增加有限量靶序列（如稀有可以增加有限量靶序列（如稀有mRNAmRNA））的灵敏度，并且提高了困难的灵敏度，并且提高了困难PCRPCR的特异性。

的特异性巢式巢式PCR一般一般PCR策略二：多重策略二：多重PCRPCR（（mulitiplex PCR））Ø 多对引物同时扩增一份多对引物同时扩增一份DNADNA模板模板Ø多重多重PCRPCR的技术要素主要包括目的片段选择、引的技术要素主要包括目的片段选择、引物设计、复性温度和时间、延伸温度和时间、各物设计、复性温度和时间、延伸温度和时间、各反应成分的用量反应成分的用量策略三：递减策略三：递减PCRPCR（（TouchDown PCR））Ø 递递减减PCRPCR通通过过在在PCRPCR的的前前几几个个循循环环使使用用严严紧紧的的退退火火条条件件提提高高特特异异性性循循环环设设在在比比估估算算的的TmTm高高大大约约5℃5℃的的退退火火温温度度下下开开始始，，然然后后每每个个循循环环降降低低1℃1℃到到2℃,2℃,直到退火温度低于直到退火温度低于Tm 5℃Tm 5℃Ø 特特异异性性最最高高的的目目的的模模板板会会被被优优先先扩扩增增，，这这些些产产物在随后的循环中继续扩增占据优势物在随后的循环中继续扩增占据优势Ø 递递减减PCRPCR对对于于那那些些不不了了解解引引物物和和目目的的模模板板同同源源性性程度的方法更为有用程度的方法更为有用策略四：热启动策略四：热启动PCR PCR （（HotStart PCR））• Taq Taq DNA DNA聚合酶的最佳延伸温度在聚合酶的最佳延伸温度在72℃72℃，聚合，聚合酶在室温仍然有活性酶在室温仍然有活性 •在进行在进行PCRPCR反应配制过程中，以及在热循环刚反应配制过程中，以及在热循环刚开始，保温温度低于退火温度时会产生非特异开始，保温温度低于退火温度时会产生非特异性的产物性的产物v 热启动热启动PCRPCR即在反应体系达到一定温度后再启即在反应体系达到一定温度后再启动动DNADNA扩增的扩增的PCRPCRØ 主要方法主要方法• HotStart HotStart TaqTaq酶酶：： TaqTaq酶酶经经过过化化学学修修饰饰后后，，酶酶活活性性被被封封闭闭，，要要在在94-95℃ 94-95℃ 加加热热数数分分钟钟才才能能回回复复正常活力开始反应正常活力开始反应• Platinum DNAPlatinum DNA聚合酶聚合酶 •延缓加入延缓加入TaqTaq DNA DNA聚合酶手工热启动方法聚合酶手工热启动方法 •用蜡防护层将镁离子或酶包裹起来，或者将反用蜡防护层将镁离子或酶包裹起来，或者将反应成分（如模板和缓冲液）物理隔离开应成分（如模板和缓冲液）物理隔离开 策略五：使用策略五：使用PCRPCR增强剂增强剂Ø 甲甲酰酰胺胺、、DMSODMSO、、甘甘油油、、甜甜菜菜碱碱等等可可作作为为PCRPCR的的增强剂增强剂Ø 增强剂浓度要适当增强剂浓度要适当 Ø 机机理理：：降降低低熔熔解解温温度度，，从从而而有有助助于于引引物物退退火火并并辅助辅助DNADNA聚合酶延伸通过二级结构区聚合酶延伸通过二级结构区基于基于PCR的微生物分析方法的微生物分析方法1. PCR-DGGE1. PCR-DGGE（（PCR-PCR-变性梯度凝胶电泳）方法变性梯度凝胶电泳）方法 2. PCR-SSCP2. PCR-SSCP（（PCR-PCR-单链构象多态性）方法单链构象多态性）方法3. PCR-RLFP (PCR-3. PCR-RLFP (PCR-限制性片段长度多态性）方法限制性片段长度多态性）方法1. PCR-DGGE（（PCR-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis）方法）方法 • 最早用于基因点突变的检测。

最早用于基因点突变的检测Myuzer (1993)是是第一个将第一个将DGGE用于分子微生物学研究领域的研用于分子微生物学研究领域的研究者 • 目前主要用于微生物多样性检测、微生物鉴定、目前主要用于微生物多样性检测、微生物鉴定、微生物分子变异、种群异化等方面微生物分子变异、种群异化等方面1.1 原理原理• DNA DNA变性剂中变性（解链）变性剂中变性（解链）• DNADNA序列决定解链行为序列决定解链行为• 解链解链DNADNA在凝胶的不同位置停止迁移，使长度相同在凝胶的不同位置停止迁移，使长度相同而序列不同的而序列不同的DNADNA片段分离片段分离• 根据电泳条带的多寡和条带的位置、强度可以辨根据电泳条带的多寡和条带的位置、强度可以辨别出样品中微生物的种类和数量，分析土壤样品中别出样品中微生物的种类和数量，分析土壤样品中微生物的多样性微生物的多样性DGGEDGGE不不是是基基于于核核酸酸分分子子量量的的不不同同将将DNADNA片片段段分分开开，，而而是是根根据据序序列列的的不不同同，，将将片片段段大大小小相相同同的的DNADNA序序列列分开ATCG双双链链DNADNA分分子子中中，，由由于于这这四四种种碱碱基基的的组组成成和和排排列列差差异异，，使使不不同同序序列列的的双双链链DNADNA分分子子具具有有不不同同的的解解链链温温度。

度100100％变性剂：％变性剂：7M7M的尿素和的尿素和4040％的去离子甲酰胺％的去离子甲酰胺的混合物的混合物1.2 应用应用• 微生物类群多样性微生物类群多样性 • 环境微生物变化的动态检测环境微生物变化的动态检测 •  有助于发现新的微生物有助于发现新的微生物• 对功能基因多样性的研究对功能基因多样性的研究 1.3 缺点缺点• DGGE最多能分离最多能分离1kb的的DNA片段，这些序列只片段，这些序列只能提供有限的系统发育信息；能提供有限的系统发育信息；• 如果选用实验条件不当，不能保证将有一定序列如果选用实验条件不当，不能保证将有一定序列差异的差异的DNADNA片段完全分开，出现序列重叠；片段完全分开，出现序列重叠；• 有些有些细菌具有多操菌具有多操纵子，子，DGGEDGGE能将其在能将其在PCRPCR时形形成的不同序列分离开，成的不同序列分离开，这样就可就可导致致过高的估高的估计环境中的微生物多境中的微生物多样性性；；• DGGEDGGE通常只能通常只能检测到到环境中的境中的优势菌群的存在菌群的存在   氰戊菊酯处理土壤样品的氰戊菊酯处理土壤样品的PCR－－DGGE图谱分析图谱分析 2. PCR-SSCP（（PCR-restriction fragment length polymorphisms）方法）方法 PCR-SSCP分析技分析技术是一种是一种DNA单链凝胶凝胶电泳技泳技术，它根据形成不同构象的等，它根据形成不同构象的等长DNA单链在中在中性聚丙性聚丙烯酰胺凝胶中的胺凝胶中的电泳迁移率泳迁移率变化来化来检测基基因因变异异。

• 单链单链DNA片段呈复杂的空间折叠构象，这种立片段呈复杂的空间折叠构象，这种立体结构主要是由其内部碱基配对等分子内相互作体结构主要是由其内部碱基配对等分子内相互作用力来维持的用力来维持的• 当有一个碱基发生改变时，会或多或少地影响其当有一个碱基发生改变时，会或多或少地影响其空间构象，使构象发生改变空间构象，使构象发生改变• 空间构象有差异的单链空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰胺分子在聚丙烯酰胺凝胶中受排阻大小不同凝胶中受排阻大小不同• 因此，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳因此，通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，可以非常敏锐地将构象上有差异的分子分离开，可以非常敏锐地将构象上有差异的分子分离开 方法原理方法原理DNA片段长度应使用的丙烯酰胺浓度片段长度应使用的丙烯酰胺浓度DNA片段长度（核苷酸数）片段长度（核苷酸数）丙烯酰胺（丙烯酰胺（%））1kb～～700b3.5700b～～500b500b5500b～～200b200b8200b12• DNA链大小链大小• DNA链的自身结构链的自身结构• 温度温度• 电压电压影响影响DNA迁移率的因素：迁移率的因素：注意事项注意事项• 核酸片段的大小核酸片段的大小:  核酸片段越小，核酸片段越小，检测的敏感性的敏感性越高。

越高对于于<200bp的片段，可的片段，可发现70％％变异；异；300bp能能发现50％的％的变异；＞异；＞500bp的片段，的片段，仅能能检出出10％～％～30％的％的变异异（（150bp左右较好）左右较好）• 电泳温度泳温度: 保持凝胶内温度恒定是保持凝胶内温度恒定是SSCP分析最关分析最关键的因素• 凝胶的凝胶的浓度度、、厚度厚度及及长度度:一般使用一般使用5％～％～8％％的凝胶的凝胶，，尽量使凝胶越薄越好尽量使凝胶越薄越好，，凝胶板凝胶板长度在度在40cm以上• 假阴性假阴性: 如没有如没有污染，染，PCR－－SSCP分析不存在假分析不存在假阳性阳性结果，但可能出果，但可能出现假阴性假阴性结果，由于点突果，由于点突变引引起的空起的空间构象构象变化甚微，迁移率相差无几所致，尤化甚微，迁移率相差无几所致，尤其是点突其是点突变发生在生在扩增片段的两端增片段的两端时应通通过设置置阳性阳性对照，摸索照，摸索电泳条件，假阴性泳条件，假阴性结果在很大程度果在很大程度上是可以避免的上是可以避免的• 结果分析果分析: 一般形成两条一般形成两条单链带PCR产物物进行行单链凝胶凝胶电泳之前，通泳之前，通过加加热变性性产生生单链。

如如变性不性不彻底，残留双底，残留双链亦可形成一条亦可形成一条带．因此，．因此，PCR－－SSCP分析分析结果至少果至少显示三条示三条带3. PCR-RFLP（（PCR-Restriction Fragment Length Polymorphism）方法）方法   当当DNA或或RNA分子由于单碱基突变或序列重分子由于单碱基突变或序列重 排，排，使某种酶切位点增加、减少或消失，导致限制性酶使某种酶切位点增加、减少或消失，导致限制性酶切片段长度发生改变，就产生切片段长度发生改变，就产生 了限制性片段长度多了限制性片段长度多态性，由于限制性内切酶在态性，由于限制性内切酶在DNA分子上有特异的酶分子上有特异的酶切位点，根据切位点，根据 其识别序列的位置和数量，可以把大其识别序列的位置和数量，可以把大小相似而序列有差异小相似而序列有差异DNA切割成不同的片段通过切割成不同的片段通过 核核酸电泳，可将长度不等的酸电泳，可将长度不等的DNA片分离而显出其长度片分离而显出其长度多态性多态性(片段的大小片段的大小) 4. PCR-T-RFLP（（PCR-Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism）方法）方法 T-RFLP 是以荧光标记引物是以荧光标记引物PCR为基础为基础,根据末端限根据末端限制性片段长度区分出微生物群体组成的一种微生物制性片段长度区分出微生物群体组成的一种微生物群体图谱法群体图谱法.原理原理• 选取具有系统进化标记特征的选取具有系统进化标记特征的DNA序列为目的序列序列为目的序列• 用荧光物质标记用荧光物质标记1个或个或2个引物的个引物的5’端端• PCR产物用四碱基限制性内切酶进行消化，用测序产物用四碱基限制性内切酶进行消化，用测序仪识别标记末端，得到不同的末端片段峰，每一个峰仪识别标记末端，得到不同的末端片段峰，每一个峰可至少代表一种类型的微生物可至少代表一种类型的微生物• 根据峰的大小和数量，分析出微生物群体的组成和根据峰的大小和数量，分析出微生物群体的组成和动态变化。

动态变化常用的荧光物质：常用的荧光物质：四氯荧光素四氯荧光素TET(5-tetrachloro-fluorescein)绿色的六氯荧光素绿色的六氯荧光素HEX(5-hexachloro-fluorescein)蓝色的六羧基荧光素蓝色的六羧基荧光素6-FAM (6-carboxy-fluorescein)细菌细菌真菌真菌真菌真菌+细菌细菌305bp306bp307bp308bp310bp芽孢杆菌芽孢杆菌注意事项注意事项（（1））DNA模板的完整性模板的完整性（（2）标记性）标记性DNA序列区段的特异性序列区段的特异性（（3）标记性）标记性DNA的扩增的扩增（（4）四碱基限制性内切酶的选择（）四碱基限制性内切酶的选择（ HaeⅢ、、HinfⅠ、、MspⅠ ））选酶原则选酶原则（（1）能够明显区分出不同的微生物，即产生的末）能够明显区分出不同的微生物，即产生的末端片段峰大小区别明显端片段峰大小区别明显,尽量避免只差一个碱基的尽量避免只差一个碱基的情况情况（（2）消化后产生的单峰具有特异性）消化后产生的单峰具有特异性,产生的杂峰尽产生的杂峰尽可能少可能少细菌细菌16S与与23S rRNA基因之间的大小核糖体基因间基因之间的大小核糖体基因间隔序列隔序列ITS(Internal Transcribed Spacer)逐渐被关逐渐被关注。

该区段具有变异性强、分化程度高等特点注该区段具有变异性强、分化程度高等特点,其变其变异速率为异速率为16S rRNA基因的基因的10倍。