《环境微生物实验》PPT课件.ppt

实验内容实验一 显微镜使用及微生物观察（教材实验一）实验二 培养基的配制和灭菌 （教材实验六）实验三 微生物的接种计数（教材实验七）实验四 细菌革兰氏染色（教材实验四）实验五 水中大肠杆菌群的测定（教材实验十）实验一实验一 显微镜使用及微生物观察显微镜使用及微生物观察一、实验目的1.掌握显微镜的结构、原理，学习显微镜的操作和保养方法2.观察细菌的形态、尺寸，并绘图二、仪器和材料光学显微镜、擦镜纸、香柏油、二甲苯、细菌标本三、实验步骤1.显微镜的取送：右手握镜臂；左手托镜座；置于胸前 2.显微镜的旋转：镜筒朝前，镜臂朝后；置于观察者座位前的桌子上，偏向身体左侧，便于左眼向目镜内观察；置于桌子内侧，距桌沿5cm左右 3.对光：转动粗准焦螺旋，使镜筒徐徐上升，然后转动转换器，使低倍物镜对准通光孔；用手指转动遮光器（或片状光圈），使最大光圈对准通光孔，左眼向目镜内注视，同时转动反光镜，使其朝向光源，使视野内亮度均匀合适 4.低倍物镜的使用：用手转动粗准焦螺旋，使镜筒徐徐下降，同时两眼从侧面注视物镜镜头，当物镜镜头与载物台的玻片相距23mm时停止用左眼向目镜内注视（注意右眼应该同时睁着），并转动粗准焦螺旋，使镜筒徐徐上升，直到看清物象为止。

如果不清楚，可调节细准焦螺旋，至清楚为止 5.高低倍物镜的使用6.油镜的使用： A、将标本片放载物台上，用标本推进器固定，将欲检部分移至接物镜下先用低倍镜找出标本的位置，然后提高镜筒，在标本的待检部位滴香柏油一滴，再换油镜观察 B、转动粗调节器使载物台徐徐上升（或使镜筒渐渐下降），直至油镜头浸没至油中此时眼睛应从侧面观察，以免压碎标本片和损坏镜头 C、然后双眼移至接目镜，一面从接目镜观察，一面反方向缓慢地转动粗调节器（下降载物台，或上升镜筒），当出现模糊物象时，换用细调节器，转动至物象清晰为止 D、观察完毕，应先提高镜筒，并将油镜头扭向一侧，再取下标本片油镜头使用后，应立即用擦镜纸擦净镜头上的油若镜油粘稠干结于镜头上，可用擦镜纸蘸少许二甲苯擦拭镜头，并随即用干的镜纸擦去残存的二甲苯，以免二甲苯渗入，溶解用以粘固透镜的胶质物，造成镜片移位或脱落 7.镜头的擦拭：用专门的擦镜纸；擦镜头时，先将擦镜纸折叠几次，然后朝一个方向擦，不可来回擦或转动擦；如果镜头被油污污染，则可在擦镜纸上滴几滴二甲苯，然后按上述方法擦拭 8.显微镜的放大对象：是物体的长和宽，不是面积，更不是体积 9.显微镜的焦距问题：物镜离装片的远近，准焦螺旋的使用。

10.显微镜使用时物象移动方向：相反，即物象在视野何方，则装片即向该方向移动11.显微镜使用时异物的判断：目镜、物镜或装片上，通常通过移动玻片（是否在玻片上），转动转换器（是否在物镜上）来判断，剩下在目镜上 12. 实验后显微镜的安置：显微镜使用完毕后，应将玻片取下，将其机械部分用白纱布擦拭干净；转动转换器，让两个物镜偏于两旁；转动粗准焦螺旋，使镜筒下降至最低点，将反光镜竖起，蒙上红绸布，然后将显微镜锁入箱内 13.显微镜的保养避免直接在阳光下曝晒避免和挥发性药品或腐蚀性酸类一起存放透镜要用擦镜纸擦拭或醮二甲苯擦拭不能随意拆卸显微镜，尤其是物镜、目镜、镜筒不能随意拆卸避免用手指沾抺镜面显微镜放在干燥处四、实验结果 名称 形态 大小无芽孢杆菌 杆状 1.0m（15）m五、注意事项1.用显微镜观察微生物不清楚时，可对光圈（强大、弱小）、滤光片、聚光器进行调节2. 细调时可先微微向一个方向调节，如果物像越变越清晰则继续朝原方向调节，反之逆向调节六、思考题使用油镜时，为什么先要用低倍镜观察？实验二实验二 培养基的配制和灭菌培养基的配制和灭菌 培养基是用人工的办法将多种营养物质按微生物生长代谢的需要配制成的一种营养基质。

培养基中均应含有满足微生物生长发育且比例合适的水分、碳源、氮源、无机盐、生长因素以及某些特需的微量元素外还应具有适宜的酸碱度pH值、缓冲能力、氧化还原电位和渗透压 二、实验器材(1)药品和试剂：牛肉膏、蛋白陈、NaCl、10NaOH溶液、l0盐酸溶液、琼脂2)器材：小烧杯、小铝锅、天平、牛角匙、1000mL刻度烧杯、玻棒、pH试纸、试管、分装漏斗、棉花、三角烧瓶、移液管、蒸馏水、培养皿3)高压蒸汽灭菌锅、电热烘箱一、实验目的一、实验目的1、熟悉洗涤、包装、稀释水配制操作2、学习和掌握配制培养基的原理方法和步骤 3、掌握消毒和灭菌的原理方法的操作步骤三、方法与步骤1、牛肉膏蛋白胨培养基的配制(1)培养基配方：牛肉膏5.0g蛋白胨、琼脂、自来水1000mL、2)操作步骤：1）称药品按实际用量计算后，按配方称取各种药品随后放入盛有蒸馏水的大烧杯中，牛肉膏可放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶解后倒入大烧杯；也可放在称量纸上称量，再放入热水，牛肉膏便与称量纸分离，立即取出纸片蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速 2）加热溶解配制固体培养基，则将称好的琼脂放入已溶解的药品中，再加热融化，此过程中需不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，最后补足所失的水分。

3）调pH检测培养基的pH，若pH偏酸，可滴加1滴10NaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸检测，直至达到所需pH范围若偏碱，则用10 HCl进行调节pH的调节通常放在加琼脂之前应注意pH值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度4）过滤液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用4层纱布趁热过滤，以利结果的观察但是供一般使用的培养基，该步可省略5）分装按实验要求，可将配制的液体培养基分装入试管或三角瓶内分装时可用漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上面造成污染(见图41)6）加棉塞试管口和三角瓶口塞上用普通棉花(非脱脂棉)制作的棉塞，棉塞制作方法如图43棉塞的形状、大小和松紧度要合适，四周紧贴管壁，不留缝隙，才能起到防止杂菌侵入和有利通气的作用要使棉塞总长约35塞入试管口或瓶口内，以防棉塞脱落7）包扎加塞后，将三角瓶的棉塞外包一层牛皮纸，以防灭菌时冷凝水沾湿棉塞8）培养基的灭菌时间和温度，需按照各种培养基的规定进行，以保证灭菌效果和不损培养基的必要成份培养基经灭菌后，必须放37温室培养24h，无菌生长者方可使用 图 例 图41培养基分装图43棉塞制作方法 采用强烈的理化因素使任何物体内外所有的微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施称之为灭菌。

灭菌是要进行微生物纯培养的需要 实验室最常用的灭菌方法是利用高温处理达到杀菌效果高温主要是使微生物的蛋白质和核酸等重要生物大分子发生变性高温灭菌分为干热灭菌和湿热灭菌两大类湿热灭菌的效果比优于干热灭菌湿热下热量易于传递，更容易破坏保持蛋白质稳定性的氢键等结构，加速其变性此外，过滤除菌、射线灭菌和消毒、化学药物灭菌和消毒等也是微生物学操作中不可缺少的常用方法三、操作步骤()高压蒸汽灭菌法 高压蒸汽灭菌法适用于培养基、无菌水、工作服等物品的灭菌1加水将内层灭菌桶取出，再向外层锅内加入适量的水，以水面与三角架相平为至2装料将装料桶放回锅内，装入待灭菌的物品装有培养基的容器放置时要防止液体溢出，瓶塞不要紧贴桶壁，以防冷凝水沾湿棉塞3加盖将盖上与排气孔相连接的排气软管插入内层灭菌桶的排气槽内，摆正锅盖，对齐螺口，然后以同时旋紧相对的两个螺栓的方式拧紧所有螺栓（见教材图13-12），并打开排气阀；4排气加热待水煮沸后，水蒸汽和空气一起从排气孔排出一般认为，当水沸后约5min，表明锅内空气已排净5升压当锅内空气排净时，即可关闭排气阀，压力开始上升6保压当压力表指针达到所需压力刻度时，控制热源开始计时并维持压力至所需时间。

本实验用121，20min灭菌7降压达到所需灭菌时间后，关闭热源，让压力自然下降到零后，打开排气阀放净余下的蒸汽后，再打开锅盖，取出灭菌物品，倒掉锅内剩水8无菌检查将已灭菌培养基于37培养24h，无杂菌生长，即可待用二)干热灭菌法干热灭菌法适用于玻璃器皿，如试管、培养皿、三角瓶、移液管等的灭菌；1装入待灭菌物品预先将各种器皿用纸包好或装入金属制的培养皿筒、移液管筒内，然后放人电热烘箱中2升温关好电烘箱门，打开电源开关，旋动恒温调节器至所需温度刻度(本实验所需为160170)，此时烘箱红灯亮，表明烘箱已开始加热，当温度上升至所设定温度后则烘箱绿灯亮，表示已停止加温3恒温当温度升到所需温度后，维持此温度2h4降温切断电源，自然降温5.取出灭菌物品待电烘箱内温度降到70以下后，才能打开箱门，取出灭菌物品四、注意事项1.称药品用的牛角匙不要混用；称完药品应及时盖紧瓶盖调pH时要小心操作，避免回调，不同培养基各有配制特点，要注意具体操作2.使用灭菌锅应严格按照操作程序进行，避免发生事故；灭菌时，操作者切勿擅自离开，务必待压力下降到零后，才可打开锅盖3.干热灭菌时电烘箱中物品不要摆得太拥挤，以免阻碍空气流通而影响灭菌效果；灭菌物品不要与电烘箱内壁的铁板接触以免包装纸烤焦起火。

五、问题和思考1培养基配制完成后，为什么必须立即灭菌?若不能及时灭菌应如何处理？ 2. 已灭菌的培养基如何进行无菌检查？3牛肉膏蛋白胨培养基属何种培养基4. 配药品的烧杯需要灭菌吗？为什么？5高压蒸汽灭菌中为什么要把冷空气排净， 为什么在灭菌后不能骤然快速降压，并要 再放尽锅内蒸汽才能打开锅盖? 微生物接种技术是进行微生物实验和相关研究的基本操作技能 无菌操作是微生物接种技术的关键平板浇注、平板划线、斜面接种、液体接种、固体接种和穿刺接种操作均以获得生长良好的纯种微生物为目的 由于接种方法不同，采用的接种工具也有区别，如平板划线和固体斜面培养体转接时用接种环；穿刺接种时用接种针，液体转接用移液管等实验三实验三 微生物的接种和计数微生物的接种和计数 一、实验目的：了解各种微生物接种方法掌握无菌操作和平板浇注法接种技术二、实验材料和用具：酒精灯、标签 、无菌采样瓶、灭菌移液管、灭菌培养基、灭菌培养皿、灭菌试管三、方法和步骤(一)用无菌瓶采集一定量环境水样(河水、污水、游泳池水或港湾水等)， ，迅速带回实验室二)吸取1mL水样注入盛有9mL无菌水的试管中，混匀成10-1稀释液，注意在吸水样前，水样及稀释水应彻底搅动均匀。

三)吸稀释液1ml按10倍稀释法稀释成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6等连续的稀释度见教材图1313(四) 选取三个连续稀释度（例如10-4、10-5、10-6） 吸取由高倍至低倍的稀释液，每个稀释液分别注入一个培养皿，每皿1mL五)浇注平板接种（教材图1314）左手持左手持三角瓶三角瓶右手反转手掌用中指右手反转手掌用中指和无名指拨出棉塞和无名指拨出棉塞( (或或不翻转手掌用小指和不翻转手掌用小指和手掌拨出棉塞手掌拨出棉塞) )左手拿平皿，以左手拿平皿，以大拇指和中指将大拇指和中指将皿盖打开一缝皿盖打开一缝三角瓶口经火焰三角瓶口经火焰烧灼迅速倾入烧灼迅速倾入55556060的培养基的培养基约约15ml15ml盖好皿盖盖好皿盖, ,置置于桌上轻轻于桌上轻轻旋转平皿旋转平皿冷凝后即冷凝后即为平板培为平板培养基养基(六)接种水样的培养皿，倒置于37培养24h，培养到长出明显菌落四、结果与分析画图描述菌落形态报告稀释倍数，依菌落计算原则进行计算五、问题和讨论培养时，为什么要把已接种的培养基倒置保温培养？ 菌落厚，有金黄色光泽呈圆形状，可断定为金黄色葡萄球菌菌落边缘光滑，有点湿润、粘稠的圆形可断定为大肠杆菌菌落边缘褶皱不规则、淡黄色可断定为枯草芽孢杆菌菌落与菌苔菌落菌落菌苔菌苔(一一)菌落计算原则菌落计算原则 平皿菌落的计算可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，平皿菌落的计算可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，防止遗漏，也可借助于菌落计数器计数。

对那些看来相似，防止遗漏，也可借助于菌落计数器计数对那些看来相似，并且长得相当接近，但并不相触的菌落，只要它们之间的并且长得相当接近，但并不相触的菌落，只要它们之间的距离至少相当于最小菌落的直径，便应该距离至少相当于最小菌落的直。