原核蛋白表达与纯化PPT精选文档.ppt

The key of Prokaryotic protein expression and purification 北京全式金生物技术有限公司北京全式金生物技术有限公司☏☏：：400-898-03211•原核表达概述原核表达概述 •原核表达策略选择原核表达策略选择•表达结果验证表达结果验证•常见问题与实验例常见问题与实验例 上篇上篇 原核表达原核表达2Ø原核表达原理概述原核表达原理概述Ø表达载体表达载体Ø表达菌株表达菌株Ø表达条件表达条件原核表达概述原核表达概述 3原核表达原理概述原核表达原理概述表达载体表达载体目的基因目的基因重组载体重组载体表达菌株表达菌株“基因基因——载体载体——菌株菌株——培养培养”培养，诱导培养，诱导构建构建转化转化4表达载体表达载体• 启动子启动子• 融合标签融合标签 • 常用表达载体系统常用表达载体系统5常见启动子常见启动子• λpL启动子：启动子：热诱导启动子热诱导启动子• trp启动子：启动子：化学诱导启动子化学诱导启动子• trc启动子：启动子：trp+lac杂交启动子杂交启动子• tac启动子：启动子：trp+lacUV5杂交启动子；杂交启动子；pGEX（（Pharmacia）、）、pMal（（NEB））•T7/T7lac启动子启动子：：pET（（Novagen）、）、pEASY-E1/E2（（Transgen））6T7启动子启动子7T7lac启动子启动子8融合标签融合标签• 常用于蛋白检测与纯化。

常用于蛋白检测与纯化• 有时也可增加蛋白可溶性、将蛋白运转至特定位置有时也可增加蛋白可溶性、将蛋白运转至特定位置9N端融合：端融合：易于构建终止密码子来自载体易于构建终止密码子来自载体/基因基因表达量高表达量高提前终止会干扰纯化提前终止会干扰纯化二级翻译起始不影响纯化二级翻译起始不影响纯化10 C端融合：端融合：构建时注意避免移码构建时注意避免移码基因不能自带终止密码子基因不能自带终止密码子提前终止不影响纯化提前终止不影响纯化二级翻译起始会干扰纯化二级翻译起始会干扰纯化11常用常用融合融合标签标签• His·TagpET系统系统• GST·TagpGEX系统系统• MBP·TagpMal系统系统12系统名称系统名称公司公司启动子启动子抗性抗性常用标签常用标签特点特点pGEXGE(Pharmacia)tacAmpGST·Tag可溶性表达，纯化难以控制，谷可溶性表达，纯化难以控制，谷可溶性表达，纯化难以控制，谷可溶性表达，纯化难以控制，谷胱甘肽胱甘肽胱甘肽胱甘肽 一步洗脱，得到的蛋白纯一步洗脱，得到的蛋白纯一步洗脱，得到的蛋白纯一步洗脱，得到的蛋白纯度较低度较低度较低度较低, ,通常需要去掉通常需要去掉通常需要去掉通常需要去掉GSTGST·TagTagpMalNEBtacAmpMBP·Tag可溶性表达，纯化难以控制，麦可溶性表达，纯化难以控制，麦可溶性表达，纯化难以控制，麦可溶性表达，纯化难以控制，麦芽糖一步洗脱，得到的蛋白纯度芽糖一步洗脱，得到的蛋白纯度芽糖一步洗脱，得到的蛋白纯度芽糖一步洗脱，得到的蛋白纯度较低较低较低较低, ,通常需要去掉通常需要去掉通常需要去掉通常需要去掉MBPMBP·TagTagpETMerck(Novagen)T7T7lacAmpKanHis·Tag种类丰富。

标签小，无需切割，种类丰富标签小，无需切割，种类丰富标签小，无需切割，种类丰富标签小，无需切割，一般来说，对蛋白活性无影响一般来说，对蛋白活性无影响一般来说，对蛋白活性无影响一般来说，对蛋白活性无影响纯化及其方便纯化及其方便纯化及其方便纯化及其方便pEASYTransgenT7lacAmpHis·Tag同同pET系统系统常用表达载体系统常用表达载体系统13表达菌株表达菌株考虑因素考虑因素细胞特性细胞特性蛋白稳定性蛋白稳定性蛋白酶缺陷型蛋白酶缺陷型——B型菌株，缺失型菌株，缺失lon、、ompT蛋白酶蛋白酶多种常用表达菌株均为此类，如多种常用表达菌株均为此类，如BL21、、Origami、、Rosetta等等启动子启动子tactac启动子需要大肠杆菌自身的启动子需要大肠杆菌自身的RNARNA聚合酶即可：聚合酶即可：BL21BL21T7T7启动子需要能够提供启动子需要能够提供T7 RNAT7 RNA聚合酶的细胞：聚合酶的细胞：DE3DE3溶源菌溶源菌抗性抗性细胞不能与载体带有相同的抗性：细胞不能与载体带有相同的抗性：pET-28a + OrigamiB(DE3)No！！pET-21b + OrigamiB(DE3)Yes！！严谨调控严谨调控BL21(DE3)pLysS / BL21(DE3)pLysE稀有密码子稀有密码子Rosetta系列系列溶解性溶解性Origami系列系列稀有密码子稀有密码子不同生物使用密码子存在偏爱性。

某种或某几种不同生物使用密码子存在偏爱性某种或某几种tRNA的缺乏，会导致外源目的基因的缺乏，会导致外源目的基因的的mRNA 无法正常在无法正常在E. coli 里表达，是为里表达，是为“稀有稀有”密码子14表达条件表达条件• 乳糖操纵子与诱导物乳糖操纵子与诱导物• 常用表达条件的优化常用表达条件的优化15乳糖操纵子与诱导物乳糖操纵子与诱导物• 1980年，年，Guarante L等构建了以乳糖操纵子为基础的大肠杆菌表达系统等构建了以乳糖操纵子为基础的大肠杆菌表达系统 Guarante L, Roberts TM, Ptashne M. A technique for expression eukaryotic genes in bacteria. Science, 1980, 209: 1428~1430• 启动子启动子Plac + 操纵基因操纵基因lacO + 结构基因结构基因• lacI负调控：负调控： 阻遏物阻遏物lacI与操纵基因与操纵基因lacO结合，抑制表达结合，抑制表达 IPTG：半乳糖苷类似物，结合阻遏物：半乳糖苷类似物，结合阻遏物lacI使其失活，启动诱导表达使其失活，启动诱导表达• cAMP-CAP正调控正调控 cAMP结合并激活结合并激活CAP，起始转录，实现正调控，起始转录，实现正调控 葡萄糖葡萄糖抑制腺苷酸环化酶，抑制腺苷酸环化酶，ATP不能转化为不能转化为cAMP，无，无cAMP-CAP，无转录，无转录16常用表达条件的优化常用表达条件的优化• 培养基组分培养基组分• 温度温度• IPTG浓度浓度• OD值值• 培养体积与溶氧量培养体积与溶氧量17Ø根据实验目的选择表达策略根据实验目的选择表达策略Ø载体选择载体选择Ø感受态细胞选择感受态细胞选择Ø表达条件表达条件原核表达策略选择原核表达策略选择 18根据实验目的选择表达策略根据实验目的选择表达策略1.明确实验目的明确实验目的2.选择表达载体选择表达载体3.选择表达菌株选择表达菌株4.优化表达条件优化表达条件19实验目的实验目的表达策略表达策略活性分析活性分析可溶表达可溶表达制备抗原制备抗原包涵体包涵体高纯度高纯度融合标签融合标签结构研究结构研究天然蛋白天然蛋白…………20选择表达载体选择表达载体系统名称系统名称公司公司启动子启动子抗性抗性常用标签常用标签特点特点pGEXGE(Pharmacia)tacAmpGST·Tag可溶性表达，纯化难以控制，谷可溶性表达，纯化难以控制，谷可溶性表达，纯化难以控制，谷可溶性表达，纯化难以控制，谷胱甘肽胱甘肽胱甘肽胱甘肽 一步洗脱，得到的蛋白纯一步洗脱，得到的蛋白纯一步洗脱，得到的蛋白纯一步洗脱，得到的蛋白纯度较低度较低度较低度较低, ,通常需要去掉通常需要去掉通常需要去掉通常需要去掉GSTGST·TagTagpMalNEBtacAmpMBP·Tag可溶性表达，纯化难以控制，麦可溶性表达，纯化难以控制，麦可溶性表达，纯化难以控制，麦可溶性表达，纯化难以控制，麦芽糖一步洗脱，得到的蛋白纯度芽糖一步洗脱，得到的蛋白纯度芽糖一步洗脱，得到的蛋白纯度芽糖一步洗脱，得到的蛋白纯度较低较低较低较低, ,通常需要去掉通常需要去掉通常需要去掉通常需要去掉MBPMBP·TagTagpETMerck(Novagen)T7T7lacAmpKanHis·Tag种类丰富。

标签小，无需切割，种类丰富标签小，无需切割，种类丰富标签小，无需切割，种类丰富标签小，无需切割，一般来说，对蛋白活性无影响一般来说，对蛋白活性无影响一般来说，对蛋白活性无影响一般来说，对蛋白活性无影响纯化及其方便纯化及其方便纯化及其方便纯化及其方便pEASYTransgenT7lacAmpHis·Tag同同pET系统系统21选择表达菌株选择表达菌株菌株菌株适合启动子适合启动子特性特性BL21tac、、trc……(pGEX、、pMal)适用于非适用于非T7启动子的表达系统启动子的表达系统BL21(DE3)T7/T7lac(pET，，pEASY)适用于适用于T7、、T7lac的表达系统，适用于非毒基因的表达系统，适用于非毒基因的表达的表达BL21(DE3)pLysST7/T7lac(pET，，pEASY)质粒质粒pLysS含有表达含有表达T7溶菌酶的基因，可结合溶菌酶的基因，可结合T7 RNA聚合酶，降低本底表达水平适用于严谨聚合酶，降低本底表达水平适用于严谨调控调控毒基因毒基因的表达的表达Rosetta(DE3)Transetta(DE3) T7/T7lac(pET，，pEASY)补充补充6种稀有密码子对应的种稀有密码子对应的tRNA，提高外源基因，，提高外源基因，特别是真核基因在原核系统中的表达水平特别是真核基因在原核系统中的表达水平OrigamiB(DE3)TransB(DE3)T7/T7lac(pET，，pEASY)具有具有thioredoxin reductase/glutathione reductase双突变，有助于形成更多的二硫键，增加蛋白的双突变，有助于形成更多的二硫键，增加蛋白的可溶性。

可溶性毒基因毒基因：基因表达产物：基因表达产物——即目的蛋白，影响宿主生长（即目的蛋白，影响宿主生长（“毒性毒性”））Page Down22Page UpBL21(DE3)pLysS、、BL21(DE3)pLysE利用利用T7溶菌酶的严谨调控机制溶菌酶的严谨调控机制23优化表达条件优化表达条件葡萄糖：葡萄糖：抑制抑制cAMP形成，进而抑制表达，严谨调控形成，进而抑制表达，严谨调控无其他严谨调控手段（无其他严谨调控手段（pLysS）且毒基因时，至关重要！）且毒基因时，至关重要！温度：温度：影响表达速率、蛋白可溶性与活性影响表达速率、蛋白可溶性与活性IPTG浓度：浓度：影响表达速率、蛋白可溶性与活性影响表达速率、蛋白可溶性与活性lac透性酶透性酶(lacY1)突变使突变使IPTG均一渗透，获得浓度依赖均一渗透，获得浓度依赖的诱导：的诱导：Tuner，，OrigamiB，，Rosetta其他因素：其他因素：菌体密度菌体密度Mg2+培养体积与通气培养体积与通气……24ArtMediaTM Protein Expression（（AM PE））• 葡萄糖抑制葡萄糖抑制cAMP形成，无形成，无cAMP-CAP，不能正调控乳糖操纵子，因而无法利，不能正调控乳糖操纵子，因而无法利用乳糖，使得大肠杆菌优先利用葡萄糖用乳糖，使得大肠杆菌优先利用葡萄糖• AM PE中含有特定配比的葡萄糖与乳糖，利用该机理，使得葡萄糖耗尽开始摄中含有特定配比的葡萄糖与乳糖，利用该机理，使得葡萄糖耗尽开始摄入乳糖时，控制细菌恰好生长到适合诱导的阶段（对数期），利用乳糖代谢，入乳糖时，控制细菌恰好生长到适合诱导的阶段（对数期），利用乳糖代谢，启动自动诱导！启动自动诱导！• 无需监控菌体生长，实现自动诱导无需监控菌体生长，实现自动诱导• 无需加入无需加入IPTG，对细菌生长无抑制，对细菌生长无抑制• 细胞密度高，蛋白产量高细胞密度高，蛋白产量高• 应用于一切乳糖操纵子表达系统：应用于一切乳糖操纵子表达系统：pET、、pGEX、、pMal、、pEASY……254123pET28a,30 kDa1：：ArtMedia 2：：LB 3：：LB+0.2% Glucose4：：SOB26载体：载体：pEASY-E1蛋白：蛋白：70 kDa菌株：菌株：Transetta(DE3)Lane 1: LB培养基，对照培养基，对照Lane 2: LB培养基，培养基，IPTG诱导诱导Lane 3: AM-PE自动诱导自动诱导载体：载体：pGEX-5X-3蛋白：蛋白：70 kDa蛋白：蛋白：30kDa菌株：菌株：BL21Lane 1: LB培养基，培养基，IPTG诱导诱导Lane 2: AM-PE自动诱导自动诱导Lane 3: LB培养基，对照培养基，对照12312327表达定位表达定位 表达结果验证表达结果验证溶解性溶解性信号肽信号肽活性活性免疫原性免疫原性产量产量纯化难度纯化难度胞内表达胞内表达可溶可溶/包涵体包涵体不需要不需要有有/无无有有最高最高≤50%≤50%蛋白种类多，需裂解蛋白种类多，需裂解菌体，复杂菌体，复杂周质表达周质表达多为可溶多为可溶需要需要有有有有较少较少≤4%≤4%蛋白种类少，需渗透蛋白种类少，需渗透压休克，相对容易压休克，相对容易胞外分泌胞外分泌完全可溶完全可溶需要需要有有有有变化变化较大较大纯化简单。

但机理不纯化简单但机理不详，成功先例少详，成功先例少表面展示表面展示融合膜蛋白融合膜蛋白/嵌合于膜上嵌合于膜上需要需要-有有-适用于疫苗开发、抗适用于疫苗开发、抗体制备，前景广阔体制备，前景广阔28表达定位表达定位菌液菌液离心离心菌体菌体细胞总蛋白细胞总蛋白培养基组分培养基组分悬菌，渗透压休克悬菌，渗透压休克菌体菌体细胞周质组分细胞周质组分悬菌，裂解，离心悬菌，裂解，离心胞质可溶组分胞质可溶组分沉淀沉淀溶解，离心溶解，离心胞质不溶组分胞质不溶组分沉淀沉淀29沉淀沉淀上清上清全菌全菌可溶表达可溶表达沉淀沉淀上清上清全菌全菌包涵体包涵体30常见问题与实验例常见问题与实验例Ø无表达或表达量低无表达或表达量低Ø蛋白不可溶蛋白不可溶Ø蛋白纯化障碍蛋白纯化障碍 31无表达或表达量低无表达或表达量低•载体载体-菌株搭配不当菌株搭配不当•摸索最佳的组合摸索最佳的组合载体载体启动子启动子菌株菌株pGEXtacBL21pMaltacBL21pETT7/T7lacBL21(DE3)BL21(DE3)pLysS Rosetta(DE3) OrigamiB(DE3)pEASYT7lac同上同上32无表达或表达量低无表达或表达量低稀有密码子稀有密码子• 影响：影响：翻译终止，移码突变，氨基酸序列错误，表达量低或无表达翻译终止，移码突变，氨基酸序列错误，表达量低或无表达• 应对：应对：在宿主中补充稀有密码子的在宿主中补充稀有密码子的tRNARosetta系列菌株（系列菌株（Novagen公司）公司）331：：BL21(DE3)；； 2：：Rosetta(DE3) ；； 3：：BL21(DE3)pLysS目的蛋白目的蛋白M12334无表达或表达量低无表达或表达量低毒基因毒基因• 影响：宿主中质粒不稳定、抑制生长或杀死宿主（溶菌）、表达量低或无影响：宿主中质粒不稳定、抑制生长或杀死宿主（溶菌）、表达量低或无表达表达• 应对：严谨调控启动子，抑制本底表达应对：严谨调控启动子，抑制本底表达选择特殊的载体（选择特殊的载体（pETcoco））选择特定的宿主菌（选择特定的宿主菌（BL21(DE3)pLysS，，BL21(DE3)pLysE ））优化培养条件与诱导表达条件优化培养条件与诱导表达条件包涵体表达包涵体表达35123pET28aLane 1：：Rosetta(DE3) Lane 2：：BL21(DE3)pLysSLane 3：：BL21(DE3)36蛋白不可溶蛋白不可溶• 成因：蛋白质正确折叠，形成有活性、有功能的天然构象的成因：蛋白质正确折叠，形成有活性、有功能的天然构象的程度程度。

• 定位：可溶蛋白定位：可溶蛋白胞质，细胞周质，胞外（培养基）胞质，细胞周质，胞外（培养基） 包涵体包涵体胞质，细胞周质胞质，细胞周质• 特点：可溶蛋白特点：可溶蛋白天然构象，正确折叠，具有生物活性天然构象，正确折叠，具有生物活性包涵体包涵体高浓度，高纯度，无活性，具免疫原性，不易水解高浓度，高纯度，无活性，具免疫原性，不易水解37增加可溶表达增加可溶表达原理原理手段手段促进正确折叠促进正确折叠融合催化二硫键形成酶的标签融合催化二硫键形成酶的标签选择促二硫键形成的细胞（选择促二硫键形成的细胞（OrigamiOrigami系列菌株）系列菌株）分泌表达分泌表达细胞周质表达，胞外分泌细胞周质表达，胞外分泌融合表达融合表达融合溶解性高的标签（融合溶解性高的标签（GSTGST，，MBPMBP））控制表达水平控制表达水平诱导温度诱导温度IPTGIPTG浓度浓度““假假””包涵体包涵体（疏水区域，膜结合等）（疏水区域，膜结合等） 特殊裂解缓冲液（去垢剂，盐，核酸酶特殊裂解缓冲液（去垢剂，盐，核酸酶…………））38123Lane 1：：37℃℃Lane 2：：30℃℃Lane 3：：25℃℃12pETpGEX39促进包涵体形成促进包涵体形成• 目的目的高浓度，高纯度高浓度，高纯度毒基因表达毒基因表达免受蛋白酶水解（小蛋白，多肽）免受蛋白酶水解（小蛋白，多肽）• 手段手段胞质表达胞质表达提升表达速率（诱导温度，提升表达速率（诱导温度，IPTG浓度，浓度，etc））特定的表达载体（特定的表达载体（pET-17xb，，pET-31b(+)））40蛋白纯化障碍蛋白纯化障碍 •表达表达——纯化是一个完整的、密切联系的过程，蛋纯化是一个完整的、密切联系的过程，蛋白纯化过程中，很多问题的根源来自上游表达白纯化过程中，很多问题的根源来自上游表达•蛋白不结合，洗脱杂带多，包涵体不易溶解蛋白不结合，洗脱杂带多，包涵体不易溶解……•下篇详述下篇详述41• 纯化策略选择纯化策略选择 • 亲和层析与离子交换层析亲和层析与离子交换层析• 层析方法的组合与顺序层析方法的组合与顺序• 包涵体纯化与复性包涵体纯化与复性 下篇下篇 蛋白纯化蛋白纯化42Ø根据蛋白自身特点选择纯化方案根据蛋白自身特点选择纯化方案Ø常用实验流程常用实验流程纯化策略选择纯化策略选择43蛋白自身特点蛋白自身特点•可溶可溶/包涵体包涵体 •融合标签融合标签•表面净电荷表面净电荷•分子量分子量•其它特点其它特点44可溶可溶/包涵体包涵体可溶蛋白可溶蛋白•无需变性步骤无需变性步骤•适用于亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等方法适用于亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等方法包涵体包涵体•需要洗涤、变性、复性（如有需要）等步骤需要洗涤、变性、复性（如有需要）等步骤•适用于某些亲和层析方法（适用于某些亲和层析方法（6×His·Tag）、离子交换层析）、离子交换层析•不适用于某些亲和层析方法（不适用于某些亲和层析方法（GST·Tag、、 MBP·Tag ））•不适用于凝胶过滤层析等方法不适用于凝胶过滤层析等方法45融合标签融合标签6×His·TagGST·TagMBP·Tag标签大小标签大小6 aa26 kDa42 kDa原理原理金属螯合层析金属螯合层析酶酶-底物特异结合底物特异结合酶酶-底物特异结合底物特异结合溶解性溶解性可溶可溶/包涵体包涵体有助可溶表达有助可溶表达有助可溶表达有助可溶表达纯化条件纯化条件天然天然/变性条件下纯化变性条件下纯化仅天然条件下纯化仅天然条件下纯化仅天然条件下纯化仅天然条件下纯化洗脱条件洗脱条件咪唑，低咪唑，低pH还原型谷胱甘肽还原型谷胱甘肽麦芽糖麦芽糖是否去除是否去除通常不需要通常不需要依实验目的而定依实验目的而定依实验目的而定依实验目的而定46表面净电荷表面净电荷与蛋白质等电点、溶液与蛋白质等电点、溶液pH值密切相关值密切相关离子交换层析的重要标准离子交换层析的重要标准分子量分子量天然构象下，蛋白分子正确折叠，近似球形，大小与分子量成正比天然构象下，蛋白分子正确折叠，近似球形，大小与分子量成正比凝胶过滤层析的重要标准凝胶过滤层析的重要标准其他特点其他特点利用蛋白质本身的特点进行亲和层析利用蛋白质本身的特点进行亲和层析耐热蛋白可用热变性法进行纯化耐热蛋白可用热变性法进行纯化47常用实验流程常用实验流程•菌体裂解菌体裂解•蛋白预处理蛋白预处理•层析纯化层析纯化48菌体裂解菌体裂解冻融冻融去垢剂去垢剂溶菌酶溶菌酶超声破碎超声破碎原理原理冰晶冰晶+ +溶胀溶胀化学化学酶解细胞壁酶解细胞壁机械作用机械作用优点优点简便简便温和温和温和温和彻底彻底打断分子打断分子（（DNADNA））缺点缺点活性略有损伤活性略有损伤容易起泡容易起泡需要合适条件需要合适条件伤害活性伤害活性发热发热避免蛋白质降解避免蛋白质降解•低温低温•蛋白酶抑制剂蛋白酶抑制剂49蛋白质预处理蛋白质预处理(可溶可溶)初分离初分离/ /粗纯粗纯• DNADNA去除去除• 热变性（对耐热蛋白）热变性（对耐热蛋白）交换交换BufferBuffer• (NH4)2SO4沉淀沉淀• 透析透析50蛋白质预处理蛋白质预处理(包涵体包涵体)• 洗涤洗涤• 变性溶解变性溶解13Lane 1：洗涤前：洗涤前Lane 2：洗涤：洗涤Lane 3：洗涤后：洗涤后251层析纯化层析纯化选择适当层析方法选择适当层析方法• 亲和层析亲和层析• 离子交换层析离子交换层析• 凝胶过滤层析凝胶过滤层析5253亲和层析亲和层析• 利用分子与其配体间特殊的、可逆性的亲和结合作用利用分子与其配体间特殊的、可逆性的亲和结合作用而进行分离的一种层析技术。

而进行分离的一种层析技术• 特异性特异性 酶酶——底物底物 抗原抗原——抗体抗体 配体配体——受体受体• 可逆性可逆性 改变条件可以使结合解除改变条件可以使结合解除54金属螯合层析金属螯合层析——6×His·Tag纯化纯化•基本原理与特点基本原理与特点•常用纯化流程常用纯化流程 •常见问题与技巧常见问题与技巧55基本原理与特点基本原理与特点• 利用蛋白质表面暴露的一些氨基酸残基和载体之上的金利用蛋白质表面暴露的一些氨基酸残基和载体之上的金属离子之间的相互作用而进行的亲和纯化属离子之间的相互作用而进行的亲和纯化• Ni-Beads 基质：琼脂糖凝胶基质：琼脂糖凝胶 侧链：侧链：NTA、、IDA 配基：配基：Ni2+56Ni2+与组氨酸形成配位键与组氨酸形成配位键57Ni-NTANi-IDA58常用纯化流程常用纯化流程• 样品处理样品处理• 装柱，平衡装柱，平衡• 上样上样• 洗涤与洗脱洗涤与洗脱• 再生再生59常见问题与技巧常见问题与技巧蛋白不结合蛋白不结合• 无标签无标签——构建有误、提前终止（构建有误、提前终止（C端）、二级翻译起始（端）、二级翻译起始（N端）端） 测序，重新构建测序，重新构建• 标签未暴露标签未暴露——变性不充分，天然蛋白折叠变性不充分，天然蛋白折叠 充分变性充分变性• 结合条件不合适结合条件不合适——螯合剂、还原剂、咪唑、螯合剂、还原剂、咪唑、pH值值…… 螯合剂螯合剂EDTA≤0.1 mM（忌用）（忌用） 还原剂还原剂DTT≤1 mM（不推荐）（不推荐）β-ME≤20 mM（慎用）（慎用） 咪唑咪唑 ≤20 mM（因蛋白而异）（因蛋白而异）601-S 1-FT 2-S 2-FT样品样品1：：0.5 mM EDTA样品样品2：无：无EDTA61蛋白杂带多蛋白杂带多• 洗脱条件不合适洗脱条件不合适——咪唑浓度、咪唑浓度、pH值值 梯度洗脱梯度洗脱• 非特异性结合非特异性结合 上调初始咪唑浓度上调初始咪唑浓度 β-ME 非离子型去垢剂、甘油、非离子型去垢剂、甘油、NaCl……• 蛋白不完整蛋白不完整——蛋白降解、提前终止（蛋白降解、提前终止（N端）、二级翻译起始（端）、二级翻译起始（C端）端） 低温，蛋白酶抑制剂低温，蛋白酶抑制剂 重新构建重新构建• 填料过多填料过多62无初始咪唑无初始咪唑10 mM 初始咪唑初始咪唑填料过多填料过多63无无β-ME有有β-ME64N端融合端融合C端融合端融合65蛋白提前洗脱蛋白提前洗脱• 洗脱条件不合适洗脱条件不合适——咪唑浓度、咪唑浓度、pH值值 改变洗脱条件改变洗脱条件• 蛋白结合能力弱蛋白结合能力弱 下调初始咪唑浓度下调初始咪唑浓度66蛋白洗脱无检出蛋白洗脱无检出• 洗脱条件不合适洗脱条件不合适——咪唑浓度、咪唑浓度、pH值值 增加洗脱强度增加洗脱强度• 蛋白结合能力强蛋白结合能力强 上调初始咪唑浓度上调初始咪唑浓度• 蛋白浓度低蛋白浓度低 Western Blot 优化表达优化表达• 蛋白未结合或被提前洗涤蛋白未结合或被提前洗涤 电泳检查全部样品：上样前、流出、洗涤、洗脱电泳检查全部样品：上样前、流出、洗涤、洗脱67S FTWashElute1Elute2Elute3Elute4Elute5咪唑浓度：咪唑浓度：Lane S：：10 mMLane Wash ：：20 mM Lane Elute1~5：： 40 mM, 80 mM, 120 mM, 160 mM, 200 mM68GST标签基本原理与特点标签基本原理与特点GST：：Glutathione S-transferase，谷胱甘肽，谷胱甘肽S-转移酶转移酶填料：填料：固定于基质的谷胱甘肽固定于基质的谷胱甘肽原理：原理： GST与谷胱甘肽的特异性结合（酶与底物）与谷胱甘肽的特异性结合（酶与底物）洗脱：洗脱：还原型谷胱甘肽还原型谷胱甘肽特点（以特点（以pGEX系统为例）系统为例）N端融合端融合有助正确折叠，多为可溶表达有助正确折叠，多为可溶表达不适用于变性条件的纯化不适用于变性条件的纯化标签可以切除标签可以切除填料没有理想的再生方法填料没有理想的再生方法69GSTGST 融合蛋白融合蛋白10 mM Glutathione70离子交换层析离子交换层析• 离子交换层析原理离子交换层析原理• 离子交换层析分类离子交换层析分类• 离子交换层析特点离子交换层析特点71离子交换层析原理离子交换层析原理7273离子交换层析分类离子交换层析分类按活性基团分按活性基团分 • 阴离子交换剂：阴离子交换剂：DEAE、、Q……• 阳离子交换剂：阳离子交换剂：CM、、S、、P11……按基质材料分按基质材料分• 离子交换树脂离子交换树脂• 离子交换纤维素离子交换纤维素• 离子交换葡聚糖：离子交换葡聚糖：Sephadex• 离子交换琼脂糖：离子交换琼脂糖：Sepharose74离子交换层析特点离子交换层析特点原理：待纯化物质与填料的静电作用原理：待纯化物质与填料的静电作用洗脱：离子强度，洗脱：离子强度，pH值值特点特点无需融合标签，理论上可纯化任何蛋白无需融合标签，理论上可纯化任何蛋白适用于天然或变性条件的纯化适用于天然或变性条件的纯化需要灵活调整需要灵活调整pH值与离子强度值与离子强度填料可用高盐浓度简单再生填料可用高盐浓度简单再生75S FT Wash Elute1Elute2Elute3Elute4填料：填料：P11目的蛋白目的蛋白20 kDa，，pI=9.02平衡缓冲液平衡缓冲液pH7.4, 20 mM KCl76•需要结合待纯化蛋白的特性，综合考虑各种纯化方法的适需要结合待纯化蛋白的特性，综合考虑各种纯化方法的适用条件，选择合适的纯化方法与不同纯化步骤的次序。

用条件，选择合适的纯化方法与不同纯化步骤的次序•例如：例如：His蛋白纯化时，要小心蛋白纯化时，要小心Buffer中螯合剂中螯合剂（（EDTA）与还原剂（）与还原剂（DTT）的影响）的影响•而进行离子交换纯化时，则必须考虑而进行离子交换纯化时，则必须考虑Buffer与样品的与样品的pH值和离子强度，值和离子强度，尤其是细菌裂解后，细胞内物质的释放对尤其是细菌裂解后，细胞内物质的释放对pH值与离子强度的影响值与离子强度的影响•硫酸铵沉淀与透析的搭配使用硫酸铵沉淀与透析的搭配使用•包涵体蛋白的变、复性与纯化包涵体蛋白的变、复性与纯化纯化方法的组合纯化方法的组合77以某蛋白质为例，组合不同的纯化方法以某蛋白质为例，组合不同的纯化方法pI/MW: 6.31 / 75 kDa，，pET28a/BL21(DE3)方法方法1：：确认表达确认表达→裂解菌体、离心保留上清裂解菌体、离心保留上清→His纯化纯化 ，确认纯化效，确认纯化效果果 →合并目的蛋白，透析合并目的蛋白，透析 →DEAE纯化纯化 ，确认目的蛋白，确认目的蛋白→ 合合并目的蛋白并目的蛋白方法方法2：：确认表达确认表达→裂解菌体、离心保留上清裂解菌体、离心保留上清→硫酸铵沉淀、溶解、透硫酸铵沉淀、溶解、透析析→DEAE纯化纯化 ，确认目的蛋白，确认目的蛋白→His纯化纯化 ，确认纯化效果，确认纯化效果 →合并目的蛋白，透析合并目的蛋白，透析 →合并目的蛋白合并目的蛋白78DEAENi-NTA79DEAENi-NTA80• 包涵体洗涤包涵体洗涤 • 包涵体变性与纯化包涵体变性与纯化 • 包涵体复性包涵体复性 包涵体纯化与复性包涵体纯化与复性81包涵体洗涤包涵体洗涤 • 目的：目的：去除沉淀中的杂质，粗纯化包涵体蛋白去除沉淀中的杂质，粗纯化包涵体蛋白• 沉淀：沉淀：包涵体包涵体细胞膜碎片细胞膜碎片+膜蛋白膜蛋白杂蛋白（氢键杂蛋白（氢键/二硫键二硫键/疏水作用疏水作用/静电结合）静电结合）• 洗涤洗涤buffer2 MUrea1%Triton X-100（中性去垢剂）（中性去垢剂）1 mMDTT0.1 mMEDTA0.5 MNaCl82包涵体洗涤包涵体洗涤 • 正常现象正常现象 上清有较浅颜色或基本透明上清有较浅颜色或基本透明 沉淀量没有明显减少或略有减少沉淀量没有明显减少或略有减少• 异常现象异常现象 上清颜色较深或半透明；沉淀量明显减少上清颜色较深或半透明；沉淀量明显减少 原因：目的蛋白（包涵体）可能被洗涤原因：目的蛋白（包涵体）可能被洗涤Buffer溶解溶解 对策：保留上清，电泳验证。

调整洗涤对策：保留上清，电泳验证调整洗涤Buffer组分，减少洗涤次数组分，减少洗涤次数• 洗涤效果好坏，直接影响包涵体纯化的纯度洗涤效果好坏，直接影响包涵体纯化的纯度！！8313Lane 1：洗涤前：洗涤前Lane 2：洗涤：洗涤Lane 3：洗涤后：洗涤后284包涵体变性与纯化包涵体变性与纯化 包涵体变性原理包涵体变性原理• 变性溶解：变性溶解：变性变性→溶解溶解• 包涵体成因：包涵体成因： 未正确折叠导致不溶未正确折叠导致不溶• 解决手段：解决手段：变性即解链，解链即可溶变性即解链，解链即可溶• 彻底变性与否，是包涵体纯化的关键彻底变性与否，是包涵体纯化的关键85变性方法变性方法• 变性剂变性剂尿素尿素/盐酸胍盐酸胍8 M/6 M• 助溶剂助溶剂SDS≤≤0.5%• 还原剂还原剂DTT/β-ME • pH磷酸钠系统磷酸钠系统~8.0• 其它助溶手段：其它助溶手段：加热加热/极端极端pH值值……86尿素尿素盐酸胍盐酸胍浓度浓度8 M8 M6 M6 M变性能力变性能力弱弱强强成本成本低低高高适合层析适合层析亲和层析亲和层析离子交换离子交换亲和层析亲和层析变性剂比较变性剂比较87二硫键与还原剂对变性的影响二硫键与还原剂对变性的影响• 二硫键二硫键 2个个SH基被氧化而形成基被氧化而形成 • 有助于蛋白质正确折叠有助于蛋白质正确折叠 阻碍包涵体的彻底变性（溶解）阻碍包涵体的彻底变性（溶解）• 还原剂：还原剂：DTT/β-ME 可将二硫键还原可将二硫键还原 通常辅助尿素、通常辅助尿素、SDS使用使用88DTTDTTβ-MEβ-ME还原能力还原能力强强弱弱气味气味/ /毒性毒性低低高高Ni-BeadsNi-Beads不推荐不推荐≤20 mM (10 mM)≤20 mM (10 mM)还原剂比较还原剂比较89包涵体复性包涵体复性 复性方法复性方法• 稀释复性稀释复性• 透析复性透析复性• 柱上复性柱上复性 蛋白与填料结合或在填料中移动，减少了复性过程中聚集形成沉淀蛋白与填料结合或在填料中移动，减少了复性过程中聚集形成沉淀的可能的可能90复性技巧复性技巧• 低温，低浓度低温，低浓度• 缓慢去除变性剂缓慢去除变性剂• 氧化氧化/还原环境还原环境• 助溶剂：甘油助溶剂：甘油• 中性中性pH值，适当离子强度值，适当离子强度91谢谢 谢！谢！北京全式金生物技术有限公司北京全式金生物技术有限公司☏☏：：400-898-032192若有不当之处，请指正，谢谢！93。