详细介绍抗体的分离纯化.pptx

2016.12.05,1,抗体的制备、纯化及其应用,,12/12/2016,2,抗体的分离和纯化,12/12/2016,抗体的分离纯化,3,无论是将抗体用于研究还是用于检测或临床治疗，均需对抗体进行分离与纯化 分离：将抗体从其存在的体液或培养液中分离出来并加以初步纯化 纯化： 提高分离出来的抗体的纯度，并将其中的杂质控制在所需的低水平对治疗性抗体尤为重要12/9/2016,4,一、样品处理,天然和重组型抗体主要污染物来源的总结,,12/9/2016,5,在样品纯化前要做的主要工作有： • 除去某些杂质，如脂蛋白或者苯酚红等 • 除去大量的杂志，如粗品中的含量大的杂蛋白等 • 更换缓冲液并除盐，把样品换到合适的缓冲液中（PH和盐浓度），并除去没有用处的小分子12/9/2016,6,纯化前除去特定的杂质,脂蛋白,脂蛋白和其它含脂物质能够阻塞色谱层析柱，最好能在纯化前除去，腹水通常含有高浓度的脂蛋白方法一： 在二价离子存在的情况下，硫酸右旋葡糖酐能够沉淀脂蛋白，沉淀可以通过离心除去步骤如下： 1．每毫升样品中加入0.04ml 10%的硫酸右旋葡糖酐和1ml 1M的CaCl2； 2．混合15分钟； 3．10,000g离心10分钟； 4．丢弃沉淀； 5．使用脱盐柱将样品换到适合纯化的缓冲液中；,注意：离心通常能够避免过滤时造成的蛋白非特异性吸附，血清蛋白样品可以通过玻璃绒毛过滤以除去酯类。

12/9/2016,7,步骤如下: 1.加入固体PVP到样品溶液中,至最终浓度为3%(w/v); 2.在4度搅拌4小时; 3.17,000g离心; 4.丢弃沉淀; 5.使用脱盐柱将样品换到适合纯化的缓冲液中;,,方法二: PVP(聚乙烯吡咯烷酮)能产生一个pH值依赖的沉淀效应,PVP在pH=7.0时能够沉淀b-脂蛋白和球蛋白,但是脂蛋白不能够在低于pH4.0时沉淀12/9/2016,8,苯酚红是一种在实验室细胞培养中的pH指示剂,虽然并不直接的影响纯化,但是苯酚红可能结合到某些纯化介质上,应该尽可能早的被除去苯酚红能够在pH7时结合在阳离子柱上苯酚红,注意 ：使用脱盐柱除去苯酚红,并且把样品转移到合适的缓冲液中以做进一步纯化12/9/2016,9,血清、腹水、细胞悬浮物或者细胞裂解物的净化,离心或者过虑是实验室净化样品最常用到的手段，这些方法适用于任何来源的少量样品注意：离心或者过虑后马上进行色谱层析纯化离心用于除去大多数颗粒物质，如细胞碎片如果在离心后样品仍然混浊，可以再选用一次5um的滤膜过滤，再用滤膜再次过滤注意： 对于少量的样品或者蛋白能吸附在滤膜上，可以用10000×g离心15分钟。

对于细胞样品，可以在40000到50000×g离心15分钟，若样品需要短处理时间，可以减少到10到15分钟 离心时使用冷冻功能，并且在冷室或者离心机中提前预冷转子 血清样品可以在离心之后用玻璃绒毛过滤以除去剩余的酯类一、离心和过滤,,12/9/2016,10,过滤能除去颗粒物质醋酸纤维素膜和PVDF(聚偏氟乙烯)膜能够有效的减少对蛋白的非特异性吸附在色谱层析前，依照色谱层析的胶粒大小选择合适的滤膜孔径，这些列在下表中选择滤孔大小,注意： 用一个预跑来检测目标蛋白的收率，因为有时候样品可能被滤膜表面非特异性吸附 过滤器可能会饱和——就是滤膜有一个特定的载量，因此在建立一个纯化步骤时，需要考虑这些影响离心法的因素,离心机的种类、离心方法、离心介质以及密度梯度 （一）离心速度 低速离心一般用离心速度，即转子每分钟的转数表示，如5000r/min等 高速离心和超速离心时，往往以相对离心力（RCF）表示，如60000×g等 相对离心力是指颗粒所受到的离心力与地心引力之比值即：,,12/9/2016,7,（二）离心时间,依据离心方法的不同，离心时间的概念也有差别 常速离心、高速离心和差速离心的离心时间，是指颗粒从离心管中样品液的液面完全沉降到管底的时间，即沉降时间； 密度梯度离心的离心时间，是指形成界限分明的区带时间，即区带形成时间；等密度梯度离心所需的离心时间，是指颗粒完全到达等密度点的平衡时间，即平衡时间。

8,离心时间过长或过短，都会影响颗粒在离心管内的预期位置，降低分离效果12/9/2016,,12/9/2016,（三）温度,为防止欲分离物质在离心过程中的聚集、变形和失活，离心温度一般控制在4 ℃左右 离心速度较低或者物质的耐热性较好，也可以在室温条件下进行 超速离心和高速离心，转子高速旋转会发热而引起温度升高，必须采用冷冻系统13,（四）pH,离心介质的pH必须是处于待分离物质稳定的pH范围内，必要时可用缓冲溶液 pH过高或过低都可能引起生物活性物质的变性、失活，还可能引起转子和离心机其它部件的腐蚀，应加以注意12/9/2016,第二节 沉淀分离,14,,如果样品中含有大量的低分子污染物,使用脱盐柱作为第一步色谱层析制备样品增加盐浓度能够增强蛋白间的疏水相互作用,疏水性的不同导致了一个选择性沉淀使用沉淀法去除大量的杂质低分子污染物,一、盐析法,在物质的水溶液中添加一定浓度的中性盐，使物质的溶解度减小而沉淀析出，这一过程称为“盐析”优点：①成本低，不需要昂贵的设备； ②操作简便，安全； ③对许多生物活性物质具有稳定作用； ④对pH、温度要求不严格 缺点：分离效果有限,,12/9/2016,15,常用的沉淀剂,,12/12/2016,蛋白质在水溶液中的溶解度是由蛋白质亲水基团、与水形成水化膜的程度、以及所带有电荷的情况决定的。

当中性盐加入蛋白质溶液中，盐离子对水分子的亲和力大于蛋白质，于是减弱甚至消除蛋白质分子周围的水化膜同时，盐离子所带的电荷中和部分蛋白质分子表面电荷，更加导致其溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀16,,（一）盐析的基本原理,,12/12/2016,常用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、氯化钠和磷酸钠等 硫酸铵最为常用，其优点是：溶解度大；温度系数小；密度小，有利于析出蛋白的离心分离；蛋白沉淀物在2 mol/L~3 mol/L硫酸铵溶液中稳定，低温下可保存一年；价廉易得；分离效果比其它盐好 但硫酸铵缓冲能力比较弱，pH难控制；铵离子干扰蛋白质的测定，所以有时也用其它中性盐进行盐析 高浓度盐析法是粗纯样品的常用方法17,,（二） 盐类和浓度的选择,硫酸铵沉淀通常作为蛋白浓缩纯化的第一步这个方法通常可以有效的除去大量白蛋白、铁传递蛋白和其它大量可溶杂质18,饱和硫酸铵溶液: 100ml蒸馏水中加入100g硫酸铵,搅拌溶解; 1M Tris Hcl pH8.0; 作为第一步纯化的缓冲液,所需溶液:,1.过滤(0.45um),或者10,000g 4度离心; 2.在10份样品中加入1份Tris Hcl pH8.0,以保持pH值; 3.温和搅拌,逐滴加入硫酸铵溶液到50%饱和度,搅拌一小时; 4.10,000g离心20分钟 5.去除上清,用等体积的硫酸铵重悬洗涤沉淀两次 (例如,不能够重悬蛋白或者进一步沉淀蛋白的溶液),再次离心; 6.用少量下步中所用缓冲液重悬沉淀; 7.硫酸铵可以在superdex G25中得到除去; *通过调整硫酸铵浓度既可以沉淀目的分子,又可以沉淀杂质。

⚠️离心后丢弃脂蛋白, 样品可以通过玻璃绒毛以出去脂类一些抗体可能被直接使用固体硫酸铵所破坏,硫酸铵沉淀应该尽可能的使用液体,在重悬时尽可能避免气泡的产生⚠️在硫酸铵沉淀后,使用HIC作为后续步骤是最方便的 通常,可重复的纯化过程,应该避免使用硫酸铵沉淀,而选择用proteinG 或proteinA Sepharose柱子通常,盐沉淀应该在蛋白浓度低于1mg/ml时进行加入等体积的饱和溶液(甚至35%-40%),能够减少铁转移蛋白和白蛋白的污染硫酸铵沉淀,,12/12/2016,（三） 影响盐析的因素,1. 蛋白质的浓度 过高过低都不好，一般认为2.5 %~3.0%蛋白质浓度比较合适 2. pH 蛋白质所带的净电荷越多，溶解度越大盐析时溶液pH常选择接近蛋白质等电点，使蛋白质的净电荷接近零 3. 温度 盐析一般对温度要求并不严格，可在室温下进行但对温度敏感的物质，要求在0 ℃~4 ℃进行，防止蛋白质变性 4. 离子强度 离子强度越高，蛋白质溶解度越低，盐析也越易发生不同蛋白质发生盐析所需要的离子强度不同,19,,,12/12/2016,蛋白质用盐析沉淀分离后，需要将蛋白质中的盐除去，常用的方法有： 透析法 超滤法 葡聚糖凝胶G50层析法。

20,,（四）脱盐,,12/12/2016,第三节 离子交换层析法,离子交换层析法（ion exchange chromatography， IEC） 是利用离子交换剂上可交换离子与组分中的离子发生可逆交换时结合力的差别，而进行分离的一种技术 广泛应用于很多生命物质的分析、制备和纯化等21,优点： ①重现性好，简单易行； ②分辨力强，回收率高； ③具有多孔性，表面积大、交换容量大； ④具有亲水性，对大分子的吸附不牢固，层析条件温和，不致引起物质变性或失活12/12/2016,22,离子交换法的固定相是离子交换剂； 若担体带有正电荷，可吸附着负电荷分子，则为阴离子交换法；不带净电荷的分子，以及阳离子则直接流出，不会被吸附上去 这些被固相单体所吸附的离子，统称为 counter ion（抗衡离子），因为其电荷与担体上的电荷相反 (counter 是 “相反“ 的意思),离子交换剂为人工合成的惰性高分子聚合物，其上带有许多可电离基团，根据这些基团所带电荷的不同，可分为阴离子交换剂和阳离子交换剂它可分三部分：高分子聚合物基质、电荷基团和平衡离子一、 基本原理,,12/12/2016,阳离子交换反应：R-A- H+ + Y+ —R-A- Y+ + H+ 阴离子交换反应：R-B+ OH- + X- —R-B+ X- + OH- R代表离子交换剂的高分子聚合物基质， A- 和B+分别代表阳离子交换剂和阴离子交换剂中与高分子聚合物共价结合的电荷基团， H+ 和OH-分别代表阳离子交换剂和阴离子交换剂的平衡离子， Y+ 和X-分别代表溶液中的离子基团。

23,,12/12/2016,24,离子交换层析对物质的分离通常是在一根充填有离子交换剂的玻璃管（1.5 cm×15 cm）中进行的含有预被分离的离子的溶液通过离子交换柱时，各种离子即与离子交换剂上的荷电部位竞争结合 任何离子通过柱时的移动速率取决于与离子交换剂的亲和力、电离程度和溶液中各种竞争性离子的性质和浓度12/12/2016,25,,12/12/2016,两性离子如蛋白质、酶类和核苷酸等物质与离子交换剂的结合力，主要取决于它们的理化性质和在特定pH条件下呈现的离子状态 大多数蛋白在生理pH（pH6～8）下带负电荷，需用阴离子交换柱纯化，极端的pH下蛋白会变性失活，应尽量避免 洗脱可采用改变溶液的pH或离子强度，也可同时改变pH与离子强度的方法改变pH可能对蛋白的稳定性有较大的影响，一般采用改变离子强度的梯度洗脱 用盐浓度梯度去洗脱离子交换柱，利用泵的辅助可以使流入柱的缓冲液中盐浓度平稳地上升，当离子强度能够中和蛋白的电荷时，蛋白就被从柱上洗脱下来26,,12/12/2016,三、技术要点,（一）离子交换剂的选择和处理 两性离子如蛋白质、酶类和核苷酸等物质与离子交换剂的结合力，主要取决于它们的理化性质和在特定pH条件下呈现的离子状态。

大多数蛋白在生理pH（pH6～8）下带负电荷，需用阴离子交换柱纯化，极端的pH下蛋白会变性失活，应尽量避免 处理的目的：使交换剂充分溶胀，使其颗粒的孔隙增大，让具有交换活性的电荷基团充分暴露出来，再用酸碱浸泡，除去杂质并使其带上需要的反离子 （二）装柱和加样 选择平衡缓冲液的离子强度和pH时，首先要保证。