畜牧兽医第七章+哺乳动物胚胎与配子生物工程技术.ppt

哺乳动物胚胎工程哺乳动物胚胎工程Mammal Embryo Engineering 第一节、胚胎移植第一节、胚胎移植（（Embryo TransplantEmbryo Transplant）） 定定义义：：将将良良种种母母畜畜配配种种后后的的早早期期胚胚胎胎取取出出，，移移植植到到同同种种、、生生理理状状态态相相同同的的其其他母畜体内，使之继续发育成为新个体他母畜体内，使之继续发育成为新个体 Ø一、概述一、概述提供胚胎的母畜称为供体（提供胚胎的母畜称为供体（DonorDonor））接受胚胎的母畜称为受体（接受胚胎的母畜称为受体（RecipientRecipient））Ø二、胚胎移植的过程及意义二、胚胎移植的过程及意义1 1、充分发挥良种母畜的繁殖潜力充分发挥良种母畜的繁殖潜力2 2、加速品种改良，扩大良种畜群加速品种改良，扩大良种畜群3 3、诱产双胎，提高生产效率诱产双胎，提高生产效率4 4、防疫需要和克服不孕防疫需要和克服不孕5 5、基础研究手段基础研究手段6 6、满足畜牧业现代化的需要满足畜牧业现代化的需要1 1、、遗传物质遗传物质来自来自亲代。

亲代2 2、、营养物质营养物质来自来自受体 Ø三、胚胎移植的特点三、胚胎移植的特点Ø四、胚胎移植的生理学基础和原则四、胚胎移植的生理学基础和原则1 1、母畜发情后生殖器官的孕向发育；、母畜发情后生殖器官的孕向发育；2 2、早期胚胎呈游离状态；、早期胚胎呈游离状态；3 3、胚胎移植基本上不存在免疫问题；、胚胎移植基本上不存在免疫问题；4 4、胚胎与供受体的关系胚胎与供受体的关系 ( (一一) )生理学基础生理学基础( (二二) )胚胎移植的基本原则胚胎移植的基本原则 1 1、胚胎移植前后所处环境的一致性胚胎移植前后所处环境的一致性 ⑴⑴种属的一致性；种属的一致性； ⑵ ⑵生理的一致性；生理的一致性； ⑶ ⑶收集和移植部位的一致性收集和移植部位的一致性 2 2、胚胎发育的期限、胚胎发育的期限 不超过周期黄体的寿命不超过周期黄体的寿命 通常是在供体发情配种后通常是在供体发情配种后3-8天内收集胚胎。

天内收集胚胎3 3、胚胎的质量、胚胎的质量0-2d1-3d2-3d3-5d4-5d5-6d5-7d7-8d7-9d8-10d9-11dØ五、胚胎移植的技术过程五、胚胎移植的技术过程供受体的选择；供受体的选择；供体的超排处理与配种和受体的同期发情；供体的超排处理与配种和受体的同期发情；胚胎的收集；胚胎的收集；胚胎的检查；胚胎的检查；胚胎移植胚胎移植牛牛胚胚胎胎移移植植示示意意图图Boer胚胎移植示意图胚胎移植示意图优良公优良公Boer羊羊供体母供体母Boer羊超排羊超排手术取胚手术取胚受体母山羊同期发情受体母山羊同期发情后代后代( (一一) )供体和受体的选择供体和受体的选择供体：供体：良种母畜良种母畜受体：受体：良好的繁殖性能，健康、良好的繁殖性能，健康、 体况中上等体况中上等 ( (二二) )供体超数排卵处理供体超数排卵处理和受体和受体母畜的同期发情母畜的同期发情 1、超排目的、超排目的 得到足够量的合格胚胎得到足够量的合格胚胎 2、超排方法、超排方法  （发情9 ～ 11天）F FS SH H＋＋P PG G法法牛牛超超数数排排卵卵早：早：FSH1.5mg；； 晚：晚：FSH1.5mg早：早：FSH1.0mg；晚：；晚：FSH1.0mg早：早：FSH0.6mg+PGF2α0.4mg；晚：；晚：FSH0.6mg早：早：FSH0.4mg；晚：；晚：FSH0.4mg发情后配种或输精两次，每隔发情后配种或输精两次，每隔6h输一次输一次(为为0d)第第6～～7d冲洗子宫：盐酸利多卡因尾椎麻醉冲洗子宫：盐酸利多卡因尾椎麻醉桑椹胚～早期囊胚桑椹胚～早期囊胚PMSG法法牛牛超超数数排排卵卵发情第发情第16～～17d，注射，注射PMSG1500～～3000IU隔日注射隔日注射 hCG1000～～1500IU24～～48h发情，配种或输精（为第发情，配种或输精（为第0d））第第6～～7d冲洗子宫，获得桑椹胚～早期囊胚冲洗子宫，获得桑椹胚～早期囊胚FSH＋＋PG法法羊羊超超数数排排卵卵 早：早：FSH（国产，（国产，7.5mg/瓶）；晚：瓶）；晚：FSH 早：早：FSH；晚：；晚：FSH早：早：FSH + PGF2α2ml ；晚：；晚：FSH24～～48h发情，配种或输精两次（为第发情，配种或输精两次（为第0d））发情周期第发情周期第12～～13d（绵羊）、（绵羊）、16～～18d（山羊）（山羊）第第6d冲洗子宫，获得桑椹胚～早期囊胚冲洗子宫，获得桑椹胚～早期囊胚同时静脉注射同时静脉注射LH100～～150IU*国产国产FSH总量为总量为150～～300IU（一）（一）PMSG法法羊羊超超数数排排卵卵发情周期的发情周期的 12～～13d（绵羊）、（绵羊）、 第第16～～18d（山羊）注射（山羊）注射PMSG800～～1500IU24～～48h发情，配种或输精（为第发情，配种或输精（为第0d））同时注射同时注射hCG500～～750IU第第6d冲洗子宫，获得桑椹胚～早期囊胚冲洗子宫，获得桑椹胚～早期囊胚（二）（二）PMSG法法小小鼠鼠超超数数排排卵卵注射注射PMSG10～～20IU48小时后注射小时后注射hCG10～～20IU，，公母合笼公母合笼24小时后刺破输卵管，获得早期受精卵 3、受体母畜的同期发情、受体母畜的同期发情 与供体母畜超排同时进行。

与供体母畜超排同时进行 P P4 4、、PGFPGF2a 2a ( (三三) )供体母畜的配种供体母畜的配种 要求：要求：1 1、优良公畜的精液；、优良公畜的精液； 2 2、精子活率高、密度大且两次配种精子活率高、密度大且两次配种同期发情与超排程序同期发情与超排程序放栓发情鉴定配种0-910111213141516171819207:00 FSH 4ml18:00 FSH 4 ml7:00 FSH 2.5ml18:00 FSH 2.5ml7:00 FSH 2ml14:00 PG6ml18:00 FSH 2ml7:00 FSH 1.5ml14:00 取栓取栓18:00 FSH 1.5ml配种配种检查黄体冲胚移胚( (四四) )胚胎的收集胚胎的收集 1 1、手术法收集胚胎手术、手术法收集胚胎手术 优点：冲卵比较彻底优点：冲卵比较彻底缺点：手术对动物剌激性大缺点：手术对动物剌激性大从子宫角顶端冲洗输从子宫角顶端冲洗输卵管：卵管：牛、羊、兔牛、羊、兔胚胎在输卵管中胚胎在输卵管中从输卵管伞处冲洗从输卵管伞处冲洗输卵管：输卵管：猪、马猪、马胚胎在输卵管中胚胎在输卵管中胚胎在子宫角时胚胎在子宫角时从子宫角上端向基部冲洗从子宫角上端向基部冲洗 2 2、非手术法收集胚胎、非手术法收集胚胎优点：对动物损伤小，优点：对动物损伤小， 缺点：冲卵不彻底，需要冲卵液多缺点：冲卵不彻底，需要冲卵液多非非手手术术法法收收集集胚胚胎胎( (五五) )胚胎的检查胚胎的检查第第6 6天收集的胚胎（未拣）天收集的胚胎（未拣）1 1、检胚、检胚二细胞至四细胞胚胎二细胞至四细胞胚胎 2 2、胚胎鉴定、胚胎鉴定 ⑴⑴荧光活体染色体荧光活体染色体 醋醋酸酸荧荧光光素素（（FDAFDA，，fluoresceindiacetate）），，培养培养3-6′3-6′，活胚胎显示荧光，死胎无荧光。

活胚胎显示荧光，死胎无荧光 ⑵⑵测定代谢活性法测定代谢活性法 1h 1h测定葡萄糖的消耗量测定葡萄糖的消耗量2-5μg2-5μg以上⑶⑶ 形态学法形态学法原原核核～～ 8 8细细胞胞正正常常胚胚胎胎桑椹胚桑椹胚~早期囊胚早期囊胚异常胚胎示意图异常胚胎示意图未受精卵未受精卵未受精卵未受精卵胞质中有空泡胞质中有空泡卵卵裂裂球球脱脱落落卵卵裂裂球球分分散散卵卵裂裂球球不不规规则则受受精精卵卵退退化化透明带破裂透明带破裂透明带不规则透明带不规则卵圆形透明带卵圆形透明带㈥㈥ 胚胎的移植胚胎的移植 手术法：手术法：各种家畜各种家畜 非手术法：非手术法：牛、马牛、马( (七七) )供体和受体的观察供体和受体的观察•健康状况；健康状况；•是否发情是否发情Ø 六、胚胎移植目前存在的问题六、胚胎移植目前存在的问题和发展前景和发展前景1 1、超排效果不够稳定超排效果不够稳定2 2、胚胎回收率低胚胎回收率低3 3、移植成功率低、移植成功率低50-60%.50-60%.( (一一) ) 问题问题( (二二) )发展前景发展前景 1 1、提高稳定超排效果。

提高稳定超排效果 2 2、改进非手术法收集和移植胚胎、改进非手术法收集和移植胚胎 的技术和器具的技术和器具. . 3 3、胚胎移植技术应与胚胎切割、胚胎冷冻、、胚胎移植技术应与胚胎切割、胚胎冷冻、 早期胚胎的性别鉴定等结合起来早期胚胎的性别鉴定等结合起来第二节第二节 胚胎冷冻与体外受精胚胎冷冻与体外受精 ( (一一) )意义意义 1 1、建立胚胎库，保存优良种畜与濒危动物资源建立胚胎库，保存优良种畜与濒危动物资源2 2、使胚胎移植不受时间与地点的限制使胚胎移植不受时间与地点的限制3 3、胚胎运输取代种畜引进胚胎运输取代种畜引进Ø一、胚胎冷冻一、胚胎冷冻( (二二) )冷冻原理冷冻原理形成冰晶形成冰晶胞外水分胞外水分渗透压升高渗透压升高细胞脱水、细胞脱水、蛋白质变性蛋白质变性胞内水分胞内水分形成大的冰晶形成大的冰晶细胞死亡细胞死亡胞外溶液效应胞外溶液效应抗冻保护剂抗冻保护剂胞内形成大的冰晶胞内形成大的冰晶胞外溶液效应胞外溶液效应冷冻保护剂：甘油、冷冻保护剂：甘油、DMSODMSO、、 乙二醇、丙二醇。

乙二醇、丙二醇( (三三) )冷冻及解冻方法冷冻及解冻方法 1、缓慢降温法、缓慢降温法 以低于以低于0.2-0.8℃/min0.2-0.8℃/min速度降低到－速度降低到－70℃70℃ 再投入液氮，解冻速度也不超过再投入液氮，解冻速度也不超过25℃/min25℃/min•优点：脱水完全，细胞内不易形成冰晶优点：脱水完全，细胞内不易形成冰晶•缺点：费时，需要特殊仪器缺点：费时，需要特殊仪器 2、快速冷冻，快速解冻、快速冷冻，快速解冻胚胎采集洗涤胚胎采集洗涤加加1.4mol/L甘油中平衡甘油中平衡20′装管装管0℃平衡平衡10′以以1℃/分降分降至至 - 6 -7℃并平衡并平衡10′以以0.3-0.5℃/min降至降至-35－－-38℃后投入液氮后投入液氮投入投入37℃水水中解冻中解冻1′，然，然后用后用0.20M蔗蔗糖糖PBS液洗液洗2次　　 3、一步冷冻法、一步冷冻法　　　　　　采采用用25%25%的的甘甘油油、、丙丙二二醇醇、、乙乙二二醇醇中中的的任任何何两两种种保保护护剂剂组组成成高高浓浓度度的的玻玻璃璃化化液液，，分分两两步步移移入入低低、、高高浓浓度度的的保保护护剂剂中中，，装装管管并并在在4℃4℃平平衡衡10′10′然然后后投投入入液液氮氮。

DMSODMSO对对胚胚胎胎的毒性很大）的毒性很大）•25℃→25%25℃→25%甘甘油油13′→ 13′→ 25%25%甘甘油油、、0.25M0.25M蔗蔗糖糖10′→4℃ 10′→4℃ 25%25%甘甘油油、、25%25%丙丙二二醇醇30″→30″→液氮液氮•解解冻冻：：胚胚胎胎→25℃→25℃水水温温→0.5mol/L→0.5mol/L蔗蔗糖糖5′→5′→保存液冲洗保存液冲洗3-4→3-4→装枪移植装枪移植Ø二、体外受精二、体外受精( (一一) )卵母细胞体外成熟卵母细胞体外成熟 1、采卵：、采卵：剖腹、腹腔镜、屠宰场剖腹、腹腔镜、屠宰场 卵子分四类卵子分四类 ① ①形态正常，卵丘细胞致密形态正常，卵丘细胞致密 ② ②卵丘细胞部分脱落卵丘细胞部分脱落 ③ ③卵丘细胞全部脱落：裸卵卵丘细胞全部脱落：裸卵 ④ ④卵子已退化卵子已退化 2、未成熟卵子的培养、未成熟卵子的培养•⑴TCM-199+⑴TCM-199+胎胎牛牛血血清清+ +丙丙酮酮酸酸，，可可加加cAMPcAMP、、血血清清、、生生长长因因子子、、生生殖殖激激素素(FSH(FSH、、17β-17β-雌雌二二醇醇，，hCG)hCG) 39℃ 5%CO2 39℃ 5%CO2饱和湿度饱和湿度20-30h20-30h•⑵M199+PMSG10/ml+hCG10/ml⑵M199+PMSG10/ml+hCG10/ml 17β- 17β-雌二醇雌二醇1mg/L1mg/L 10% 10%猪卵泡液猪卵泡液•⑶10%FSC+⑶10%FSC+半胱氨酸半胱氨酸69mg/L69mg/L培养成熟牛卵母细胞( (二二) )精子体外获能精子体外获能 1、精子洗涤：、精子洗涤：多次离心多次离心 2、精子获能、精子获能 BOBO液液→→咖啡因，肝素、咖啡因，肝素、BSABSA、钙离子载体、钙离子载体 改良改良Tyrode→10mg/mlTyrode→10mg/ml肝素肝素( (三三) )体外受精体外受精•微滴：微滴： 5-105-10个个卵卵母母细细胞胞加加0.64-1×106/ml0.64-1×106/ml精精子子39℃5%CO239℃5%CO2气体气体→Tyride18-24h BO 6-8h→Tyride18-24h BO 6-8h 液滴示意图液滴示意图 卵母细胞质成熟：细胞质成熟较难鉴定，因卵母细胞质成熟：细胞质成熟较难鉴定，因此，通常只检查细胞核的成熟。

此，通常只检查细胞核的成熟 卵母细胞核染色卵母细胞核染色 制片：压片制片：压片 固定：固定液固定：固定液 乙醇：乙酸＝乙醇：乙酸＝3：：1，，24h 染色：染色：1％地衣红，％地衣红，40％乙酸％乙酸 镜检：光学显微镜镜检：光学显微镜制片、固定、染色示意图制片、固定、染色示意图 ( (四四) )早期胚胎的体外发育培养早期胚胎的体外发育培养•许许多多动动物物早早期期胚胚胎胎均均存存在在‘‘体体外外发发育育阻滞阻滞’’现象•M199+0.875g/L牛磺酸牛磺酸•6%mg/L半胱氨酸半胱氨酸5% CO2( (五五) )精子显微注射精子显微注射•指指采采用用显显微微操操作作方方法法将将处处理理后后的的精精子子核核或或完整的精子直接注入卵质，完成受精过程完整的精子直接注入卵质，完成受精过程•细胞流式分类器细胞流式分类器•基基本本程程序序：：①①精精子子注注射射前前处处理理：：精精子子核核②②借借助助显显微微操操作作仪仪将将核核直直接接穿穿过过透透明明带带和和卵卵膜膜进进入入卵质中；卵质中；③③注射后的卵母细胞体外培养。

注射后的卵母细胞体外培养胞质内授精（ICSI）带下授精第三节第三节 胚胎显微操作胚胎显微操作⒈⒈显微操作仪分割显微操作仪分割⒉⒉徒手分割徒手分割 0.1-0.2%链链霉霉蛋蛋白白酶酶软化透明带软化透明带 Ø一、胚胎分割一、胚胎分割胚胎分割胚胎分割二、细胞核移植二、细胞核移植•单单个个卵卵裂裂球球或或体体细细胞胞核核，，移移入入去去核核的的成成熟熟卵卵母母细细胞胞中中采采用用一一定定的的方方法法激激活活卵卵母母细细胞胞，，使使供供体体核核和和受受体体核核融融合合为为重重构构胚胚，，经经移移植植后后发发育成新个体的技术育成新个体的技术•““多莉多莉”doly”doly核移植的程序图核移植的程序图克隆技术路线图克隆技术路线图“多莉多莉”doly显微注射仪显微注射仪显微注射仪操作臂显微注射仪操作臂显微注射仪操作臂显微注射仪操作臂显微注射仪操作臂显微注射仪操作臂拉针仪拉针仪煅烧仪煅烧仪磨针仪磨针仪 核移植技术的操作过程核移植技术的操作过程•⒈⒈供体核的分离技术供体核的分离技术 a a、胚细胞、胚细胞　胚胎干细胞　　类胚胎干细胞　胚胎干细胞　　类胚胎干细胞 b b、体细胞、体细胞•⒉⒉受体细胞的去核技术受体细胞的去核技术 a a、受精卵：松弛素、受精卵：松弛素 b b、成熟卵母细胞　、成熟卵母细胞　•⒊⒊核卵重组技术：移入供体核核卵重组技术：移入供体核•⒋⒋卵母细胞的激活与细胞融合卵母细胞的激活与细胞融合•⒌⒌核移植胚的培养与移植或核移植胚的培养与移植或重复克隆技术。

重复克隆技术三、转基因动物三、转基因动物 是是指指将将外外源源基基因因通通过过显显微微操操作作，，整整合合到到某某种种动动物物的的基基因因组组中中，，并并使使之之在在转转录录及及翻翻译译的的水水平平上上得得以以表表达达，，从从而改变该物种的生物学特性而改变该物种的生物学特性转转基基因因动动物物的的制制备备Ø㈠转基因的意义㈠转基因的意义•⒈⒈提高家畜的经济性状，提高家畜的经济性状，•⒉⒉以家畜为畜主生产有用的生物活性物质，以家畜为畜主生产有用的生物活性物质，•⒊⒊抗病育种，抗病育种，•⒋⒋利用转基因猪生产人类所需的器官利用转基因猪生产人类所需的器官转基因动物制备过程转基因动物制备过程Ø㈡基因导入方法㈡基因导入方法1、显微注射、显微注射转基因小鼠制备过程转基因小鼠制备过程⒉⒉逆转录病毒感染法逆转录病毒感染法⒊⒊胚胎干细胞介导法胚胎干细胞介导法⒋⒋精子载体法精子载体法第四节性别控制技术第四节性别控制技术Ø㈠沉淀法㈠沉淀法 X精子体积较大，沉淀快精子体积较大，沉淀快Ø㈡梯度离心法㈡梯度离心法 X、、Y精子精子DNA含量有差异的原理，含量有差异的原理，X较较Y大大Ø㈢电泳法㈢电泳法 X、、Y精子表面所带电荷的差异精子表面所带电荷的差异 靠近正极靠近正极X、、负极负极Y 一、精子分离方法一、精子分离方法Ø㈣㈣H-YH-Y抗原法抗原法 抗抗H-Y的抗体处理精子，使的抗体处理精子，使Y精子失能精子失能Ø㈤精子的柱层析分离法㈤精子的柱层析分离法 葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶G-50 X精精子子的的DNA含含量略多干量略多干Y精子精子⒈⒈速度慢，速度慢，⒉⒉受胎率较低，受胎率较低，⒊⒊价格昂贵。

价格昂贵Ø㈥流式细胞分类器㈥流式细胞分类器二、胚胎的性别控制二、胚胎的性别控制Ø㈠细胞遗传学㈠细胞遗传学 核型分析核型分析Ø㈡㈡X X染色体连锁酶活力测定法染色体连锁酶活力测定法 雌雌性性胚胚胎胎X X染染色色体体连连锁锁酶酶的的活活性性是是雄雄性的两倍性的两倍Ø㈢㈢H-YH-Y抗原法抗原法•⒈⒈细胞毒性分析法细胞毒性分析法　　 含含有有H-YH-Y抗抗血血清清与与补补体体的的培培养养液液中中培培养养，，有有H-H-Y Y抗原的胚胎表现出一定的细胞溶解抗原的胚胎表现出一定的细胞溶解•⒉⒉间接免疫荧光法间接免疫荧光法　　 先先将将8 8细细胞胞至至囊囊胚胚期期胚胚胎胎与与H-YH-Y抗抗体体反反应应3030分分钟钟，，与与FITCFITC标标记记的的IgMIgM抗抗体体反反应应然然后后在在荧荧光光显显微微镜镜下检查胚胎是否带有荧光素，若有为雄性下检查胚胎是否带有荧光素，若有为雄性Ø㈣㈣Y Y染色体特异性染色体特异性DNADNA探针法探针法　　 用用同同位位素素标标记记的的Y Y染染色色体体特特异异序序列列的的探探针针，，用用这这一一探探针针与与从从胚胚胎胎细细胞胞中中提提取取的的少少量量DNADNA杂杂交。

交 在在雄雄性性的的DNADNA片片断断，，即即SRYSRY（（性性别别决决定定区区））与与PCRPCR扩增技术相结合，用于胚胎性别鉴定扩增技术相结合，用于胚胎性别鉴定三、外界环境三、外界环境Ø㈠控制饲养类型及营养水平㈠控制饲养类型及营养水平•谷物谷物饲料为主的酸性饲料类型多饲料为主的酸性饲料类型多雄性雄性后代后代•青绿青绿饲料为主的饲料类型多饲料为主的饲料类型多雌性雌性后代后代•营养不良营养不良时多时多雄性雄性后代后代•营养丰富营养丰富时多时多雌性雌性后代后代Ø㈡控制配制年龄㈡控制配制年龄 过过于于年年老老的的或或过过于于年年轻轻的的母母体体常常多多生雄性生雄性; ; 中年常多生雌性中年常多生雌性Ø㈢交配特点㈢交配特点•⒈⒈交配次数交配次数 雄雄兔兔于于一一天天中中进进行行多多次次交交配配，，发发现现后后代代中中的的雌性越来越多雌性越来越多•⒉⒉受孕时间受孕时间 发发情情早早期期卵卵子子刚刚排排出出时时受受孕孕后后代代雌雌性性较较多多，，发情晚期卵子过度成熟后受孕者雄性多。

发情晚期卵子过度成熟后受孕者雄性多•⒊⒊人工授精时所采用的一些其他方法人工授精时所采用的一些其他方法 在在输输精精前前20-30′, 20-30′, 精精氨氨酸酸阴阴道道内内注注入入1ml1ml：：高、低高、低→→雄，中雄，中→→雌雌 复习思考题复习思考题⒈⒈名词解释：胚胎移植、细胞核移植、转基名词解释：胚胎移植、细胞核移植、转基因动物、精子显微注射因动物、精子显微注射 、胚胎冷冻、胚胎冷冻 ⒉⒉胚胎移植的意义胚胎移植的意义 ⒊⒊胚胎移植的生理学基础胚胎移植的生理学基础⒋⒋胚胎移植的基本原则胚胎移植的基本原则 ⒌⒌胚胎移植的技术过程胚胎移植的技术过程⒍⒍胚胎移植目前存在的问题和发展前景胚胎移植目前存在的问题和发展前景 ⒎⒎胚胎冷冻的原理胚胎冷冻的原理⒏⒏性别控制有哪些技术？性别控制有哪些技术？ 。