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免疫组化操作方法、原理、步骤以及常见问题处理大总结1、 方法操作不难，最大的难处是出现异常结果时如何解决？这就需要掌握免疫组化 实验原理，每一步知道为什么这样做，这样你才敢大胆地改革先前的不对的方法步骤如抗 体孵育条件主要是抗体浓度、温度、时间，这三者一般是相互成反比的（相对），其中浓度 是最重要的先决条件，温度决定反应的速度、时间决定反应的量就拿温度来说，可以有4 度、室温、37度，我推荐4度最佳，反应最温和，背景较浅；而37度反应速度较快，时间 较短；室温我不太提倡，除非你每次都把环境温度控制在一定的范围，否则，尽量选择前两 者2、 免疫组化最大的优势是定位和定性相比于其他蛋白检测方法，免疫组化具有 定性灵敏度高、定位较直接准确，是定位检测分析首选方法尤其对于有些因子的转位研究 十分有用3、 免疫组化结果定量分析的前提是高质量的染色切片免疫组化结果也能定量分 析，但必须是背景染色浅而特异性染色较深的情况下，分析最为准确，这种原则可能也是我 们日常审稿时判定研究结果的必备条件4、 免疫组化实验一定要设置阳性对照和阴性对照阳性对照一般是用肯定表达这 种抗原的切片来做;阴性对照一般是用PBS或非一抗替代一抗来进行反应，其余步骤均一致。

前者是排除方法和实验系统有无问题；后者是排除有无一抗外的非特异性染色5、 免疫组化的应用广泛，是当前实验研究的最重要方法之一如今发SCI论文时， 明显感觉仅靠量化的数据来发文章很难，加一些形态学数据或图片，老外十分欢迎，可能是 怕你学术造假吧当然也不能做假阳性或假阴性结果6、 免疫组化技术掌握与否的鉴定标准是同一切片或不同切片中不同抗原均从摸索 浓度或条件而做出优良的染色切片我在平时带教中就发现许多研究生把我已经摸索很成熟 的反应条件、浓度、方法步骤，重复运用于同一性质的切片和同一种抗体，做出来后就觉得 自己已经掌握了免疫组化方法，更换一种抗体后，居然连二抗的种属来源都拿错了失败往 往促进你去思考试验原理和过程，成功有时也加快你自傲7、 实验方法需要动手+动脑如今我还不敢说我在免疫组化什么都知道我只所以 今天敢在这里说这说那，这是因为我经过了反复的动手+动脑，把理论原理运用于实践，在 把实践中发现的问题带到理论知识中去解决，最终把理论与实践融会贯通一、概念和常用方法介绍1、 定义用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的分布和含量 进行组织和细胞原位定性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学（immunohistochemistry）技术或免疫细胞化学（immunocytochemistry）技术。

2、 原理根据抗原抗体反应和化学显色原理，组织切片或细胞标本中的抗原先和一 抗结合，再利用一抗与标记生物素、荧光素等的二抗进行反应，前者再用标记辣根过氧化物 酶（HRP）或碱性磷酸酶（AKP）等的抗生物素（如链霉亲和素等）结合，最后通过呈色反应 或荧光来显示细胞或组织中化学成分，在光学显微镜或荧光显微镜下可清晰看见细胞内发生 的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞爬片或组织切片上原位确定某些化学成分的分布和含 量3、 分类 1）按标记物质的种类，如荧光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根 过氧化物酶和碱性磷酸酶）、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、免疫酶 标法和免疫金银法等2）按染色步骤可分为直接法（又称一步法）和间接法（二步、三 步或多步法）与直接法相比，间接法的灵敏度提高了许多3）按结合方式可分为抗原- 抗体结合，如过氧化物酶■抗过氧化物酶（PAP）法；亲和连接，如卵白素■生物素-过氧化物 酶复合物（ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等，其中SP法是比较常用的方法；聚合物链接，如即用型二步法，此方法尤其适合于内源性生物素含量高的组织 抗原检测4、 目前几种常用免疫组化方法简单介绍 1）免疫荧光方法是最早建立的免疫 组织化学技术。

它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探 针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察当抗原抗体复合物中的荧光素受激 发光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行 定量分析由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验 中应用较广2） 免疫酶标方法免疫酶标方法是继免疫荧光后，于60年代发展起来的技术基本原理是先 以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定 电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究免 疫酶标技术是目前最常用的技术本方法与免疫荧光技术相比的主要优点是：定位准确，对 比度好，染色标本可长期保存，适合于光、电镜研究等免疫酶标方法的发展非常迅速，已 经衍生出了多种标记方法，且随着方法的不断改进和创新，其特异性和灵敏度都在不断提高， 使用也越来越方便目前在病理诊断中广为使用的有ABC法、SP三步法、即用型二步法检 测系统等3） 免疫胶体金技术免疫胶体金技术是以胶体金这样一种特殊的金属颗粒作为标记物胶体 金是指金的水溶胶，它能迅速而稳定地吸附蛋白，对蛋白的生物学活性则没有明显的影响。

因此，用胶体金标记一抗、二抗或其他能特异性结合免疫球蛋白的分子（如葡萄球菌A蛋白） 等作为探针，就能对组织或细胞内的抗原进行定性、定位，甚至定量研究由于胶体金有不 同大小的颗粒，且胶体金的电子密度高，所以免疫胶体金技术特别适合于免疫电镜的单标记 或多标记定位研究由于胶体金本身呈淡至深红色，因此也适合进行光镜观察如应用银加 强的免疫金银法则更便于光镜观察5、 被检测的物质组织或细胞中凡是能作为抗原或半抗原，如蛋白质、多肽、氨 基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测6、 特点 1）特异性强免疫学的基本原理决定抗原与抗体之间的结合具有高度 特异性，因此，免疫组化从理论上讲也是组织细胞中抗原的特定显示，如角蛋白（keratin） 显示上皮成分，LCA显示淋巴细胞成分只有当组织细胞中存在交叉抗原时，才会出现交叉 反应2）敏感性高在应用免疫组化的起始阶段，由于技术上的限制，只有直接法、间接 法等敏感性不高的技术，那时的抗体只能稀释几倍、几十倍；现在由于ABC法或SP三步法 的出现，使抗体稀释上千倍、上万倍甚至上亿倍仍可在组织细胞中与抗原结合，这样高敏感 性的抗体抗原反应，使免疫组化方法越来越方便地应用于常规病理诊断工作。

3）定位准确、 形态与功能相结合该技术通过抗原抗体反应及呈色反应，可在组织和细胞中进行抗原的准 确定位，因而可同时对不同抗原在同一组织或细胞中进行定位观察，这样就可以进行形态与 功能相结合的研究，对病理学领域开展深入研究是十分有意义的7、 从蛋白水平检测角度，免疫组化技术与Western blotting、ELISA的异同1） Western blotting:蛋白质免疫印迹，也是利用抗体抗原反应原理，结合化学发光等技术来 检查组织或细胞样品内蛋白含量的检测方法与免疫组化技术相比，定量可能更加准确；当 然Western blotting也可定性和定位（通过提取膜蛋白或核蛋白、胞浆蛋白分别检测其中 抗原含量，进而间接反映它们的定位），但敏感性远远低于免疫组化技术2）ELISA:酶联 免疫吸附试验，也是利用抗体-抗原-抗原结合反应原理来检查体液或组织匀浆中蛋白含量的 检测与免疫组化技术相比，定量最准确，是分泌性蛋白检测首选方法之一二、实验流程简介1、 SP三步法 1）石蜡切片，常规脱蜡至水2） 0.3%或3%H2O2去离子水（无 色液体）孵育10-30分钟，以灭活内源性过氧化物酶活性3）蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟4）候选步骤：采用抗原修复：微波（建 议30分钟内4次中火）、高压、酶修复方法。

自然冷却，再用3分钟X3次.5）血清封闭： 室温15-30分钟，尽可能与二抗来源一致倾去，勿洗6）滴加适当比例稀释的一抗，37^ 孵育2~3小时或4°C过夜（最好复温）PBS冲洗，3分钟X5次7）滴加生物素标记的二 抗，室温或37C孵育30分钟-1h8） PBS冲洗，3分钟乂5次9）滴加SP （链霉亲和素- 过氧化物酶），室温或37C孵育30分钟-1h10） PBS冲洗，3分钟乂5次11）显色剂显 色（DAB等）12）自来水充分冲洗13）可进行复染，脱水，透明14）选择适当的封片 剂封片2、 即用型二步法 1）脱蜡、水化组织切片2）根据所应用的一抗的特殊要求， 对组织切片进行预处理3） 0.3%或3%H2O2去离子水孵育5分钟-30分钟，以阻断内源性过 氧化物酶，PBS或TBS冲洗4）滴加一抗，室温或37C孵育30~60分钟，或4C过夜，PBS 或TBS浸洗3分钟X5次5）滴加enhangcer增强剂，37度30min，PBS或TBS浸洗3分钟 X5次6）滴加通用型IgG抗体-Fab段-HRP多聚体，室温/37C孵育30分钟-1h，PBS/TBS 冲洗，3分钟乂5次7）应用DAB溶液显色。

8）蒸馏水冲洗、复染、脱水、透明、封片三、免疫荧光技术1、免疫荧光方法中的重要环节 1）冰冻切片制备：建议用新鲜组织，否则组织 细胞内部结构破坏，易使抗原弥散选用干净锋利的刀片、组织一定要冷冻适度等，防止裂 片和脱片严重2）组织切片固定：切好片风干后立即用冰西奈山环保组织固定液固定 5-10min，尤其要较长时间保存的白片，一定要及时固定和适当保存3）血清封闭：为防止 内源性非特异性蛋白抗原的结合，需要在一抗孵育前先用血清（与二抗来源一致）封闭，减 弱背景着色血清封闭的时间是可以调整的，一般10-30min4） 一抗孵育条件：在免疫组 化反应中最重要，包括孵育时间和抗体浓度一抗孵育温度有几种：4度、室温、37度，其 中4度效果最佳；孵育时间：这与温度、抗体浓度有关，一般37度1-2h，而4度过夜和从 冰箱拿出后37度复温45min具体条件还要摸索5）二抗孵育条件：二抗一般室温或37 度30min-1h，具体时间需要摸索，而浓度一般有工作液，若是浓缩液还要摸索浓度，切记 要避光反应但在免疫荧光中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下，然后去摸索一抗浓 度和孵育时间最后，荧光素标记的二抗随着保存时间的延长，可能后有大量的游离荧光素 残留，需要注意配制时小包装和并进行适当的离心。

6）复染：目的是形成细胞轮廓，从而 更好地对目标蛋白进行定位一般常用DAPI复染7）封片：为了长期保存，我们一般用缓 冲甘油等封片，此外还有专门的抗荧光萃灭封片液避免产生气泡，方法是直接在载玻片组 织上滴一滴封片液，然后一手拿住盖片某一拐角，而另一手拿对面的那个拐角，接近封片液 近端的拐角先降低，直至接触到液体时为止；当发现液体接触面在不断弥散时，则可以缓慢 降低另一拐角，这样一般不会产生气泡8）切片清洗：为了防止一抗、二抗等试剂残留而 引起非特异性染色，所以适当地加强清洗（延长时间和增多次数）尤为重要，我一般在一抗 孵育前的清洗是3min*3次，而一抗孵育后的清洗均为5次*5min注意（1）单独冲洗，防 止交叉反应造成污染2）温柔冲洗，防止切片的脱落我喜欢用浸洗方式；3）冲洗的 时间要足够，才能彻底洗去结合的物质4） PBS的PH和离子强度的使用和要求这方面 我有惨痛教训，当时我买的抗体稀释液偏酸，结果背景一片黄（未见特异性染色），建议 PH在7.4-7.6浓度是0.01M°（中性及弱硷性条件（PH7-8）有利于免疫复合物的形成，而 酸性条件则有利于分解;低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利于分解） 9）拍照：有条件的话最好立即拍照，若不能及时拍照，也要封好片和用指甲油封固，保持 避光和湿。