探讨NH4-N氮源下海洋酸化如何作用于米氏凯伦藻与东海原甲藻的生长.docx

探讨NH4-N氮源下海洋酸化如何作用于米氏凯伦藻与东海原甲藻的生长由于工业化和化石燃料的燃烧,大量的CO2释放到大气,全球大气的CO2浓度已增至400μatm[1]海洋对大气中CO2的吸收导致长时间内海洋pH的持续降低,这种现象称为海洋酸化如果目前的能源利用结构持续存在,预计到2100—2300年,大气的CO2浓度将分别升高到1000和2000,海水pH值分别降低0.4和0.77个单位,并导致海水碳酸盐系统发生显著的化学变化(pCO2,HCO-3和H+的增加以及CO2−3的减少)[2,3]随着城市化的发展和污水处理厂的建立,城市废水在进入海水之前大部分有机碳(DOC)已被转化为无机碳(DIC),即排入近海城市废水的主要碳形式是DIC,以低pH值和高DIC为特征的处理后废水可导致许多沿海地区的海水酸化[4]受大气CO2浓度升高和陆源排污的影响,近海水域的酸化问题不容忽视氮是海洋生物生长和繁殖的重要元素之一,且已成为海洋生物生长和生物群落演替的限制因素,此外,溶解无机氮(DIN)是浮游植物生长的必需营养物质[5,6,7]NH4-N作为一种还原态氮形式,可被浮游植物直接吸收利用而不需消耗较多能量,而其它两种DIN—NO3-N和NO2-N,则需要被硝酸还原酶(NR)还原成氨氮等还原态氮才能被浮游植物利用,所以在三种DIN中,浮游植物优先吸收利用NH4-N[8,9]。

在过去的几十年里,有害藻华(HABs)对世界沿海地区的海洋渔业、公共卫生和水生环境造成巨大损害[10,11,12],已经成为全世界沿海地区的主要环境问题之一[13]东海原甲藻和米氏凯伦藻是中国东南沿海地区HABs的主要优势藻种且二者存在演替现象[14,15]近年来,东海原甲藻是中国东海海域大规模HABs的主要种类,常见于浙江沿岸和长江口的表层和次表层水域[16,17,18,19]米氏凯伦藻是一种在全球广泛分布的甲藻,它常在太平洋沿岸[20,21,22,23,24,25]、大西洋[26,27,28]和印度洋[29]以及中国东海发生形成HABs米氏凯伦藻是一种典型的鱼类毒性物种,其毒性对野生鱼和养殖鱼都是致命的[30,31],除此之外,它还与贝类和其它无脊椎动物的死亡有关[32,33,34,35,36]浮游植物是主要的初级生产者,并在全球范围内影响海洋的碳循环不同浮游植物的CO2浓缩效率和调节机制不同,则其对海洋酸化的响应就不同研究表明,海洋酸化对海洋原甲藻、亚历山大藻和短孢角毛藻的生长并无明显影响[37,38,39],而三角褐指藻、牟氏角毛藻和塔玛亚历山大藻的生长却受到了海洋酸化的抑制[40,41,42]。

为此,本文选取东海原甲藻和米氏凯伦藻,在室温、模拟光照条件下,以NH4-N为氮源,通过增加pCO2改变海水的酸化程度,研究海洋酸化对米氏凯伦藻和东海原甲藻生长的影响,并分析两种甲藻对NH4-N的吸收动力学和生物酶活性,探讨其环境适应性1、材料与方法1.1实验藻种的培养为了模拟海洋酸化对东海原甲藻和米氏凯伦藻生长的影响,培养实验设置3个pH梯度:8.10(当前海水pH值)、7.81(21世纪末海水pH值)和7.45(高酸化海水pH值),分别对应通入CO2浓度为380、800和1500μatm的混合空气培养实验中使用的CO2混合空气采用称量法配置,即将纯原料气定量地从原料气瓶转移到混合气气瓶来制备,组分气体的添加量通过称量充装前后的标准气瓶来确定同时,每个pH值设置两个平行样培养实验所用东海原甲藻接种于中国海洋大学海洋化学理论与工程技术教育部重点实验室藻种室,米氏凯伦藻接种于中国科学院海洋研究所海洋生态与环境科学重点实验室藻种室,将藻种均保存于f/2培养液并置于光照培养箱中(光照强度191μmol·m-2·s-1,光暗比为12h∶12h,温度为(20±1)℃)将培养实验所用海水(胶州湾近海海域,36°5′42″N,120°15′41″E,PO4-P:0.946μmol·L-1;NO2-N:0.561μmol·L-1;NO3-N:0.842μmol·L-1;NH4-N:1.453μmol·L-1)经孔径0.45μm的醋酸纤维膜过滤以除去颗粒物,再将过滤海水置于高压灭菌锅中120℃下高温高压灭菌20min。

实验采用5L锥形瓶进行培养,向培养瓶中加入3.5L灭菌海水,以锡纸(实验前450℃下灼烧4h)为盖,分别通入不同CO2浓度的混合空气,待三个pH梯度的海水碳酸盐系统平衡后添加藻种,取100mL东海原甲藻藻液和200mL米氏凯伦藻藻液加入到3.5L灭菌海水中,使藻密度达到2000cell/mL左右,再加入NH4-N(30μmol·L-1,NH4Cl;国药集团化学试剂有限公司(SCRC))和PO4-P(1.5μmol·L-1,KH2PO4;国药集团化学试剂有限公司(SCRC)),微量元素和维生素浓度按照f/2培养液浓度比例添加(上海光语生物科技有限公司)(见表1)东海原甲藻培养实验周期为10天,米氏凯伦藻培养实验周期为20天,取样频次为1～2次/d,具体取样频次根据两种藻的生长规律而定取样前将培养体系摇匀,取200mL藻液经0.7μm的GF/F玻璃纤维膜(Whatman公司,450℃下灼烧4h)过滤,滤膜用于测定SOD酶、CAT酶活性和叶绿素,将滤液装入60mL的棕色玻璃瓶中,用于测定水体中的NH4-N,并将样品置于-20℃下保存表1东海原甲藻和米氏凯伦藻培养实验条件导出到EXCEL1.2pH的调节与测定为维持培养体系pH环境的稳定,在体系中加入生物缓冲剂HEPES[43,44](～0.04或～0.05g·L-1),并采用以间甲酚紫为指示剂的分光光度法测定体系的pH值[45]。

为观测pH的变化幅度,前期取样较密集,观测结果发现pH的波动范围不大,即在培养后期减少了对pH的观测次数测得培养体系的pH值在整个生长周期内变化范围为:0.1±0.05(见图1)图1东海原甲藻和米氏凯伦藻培养期的pH波动1.3分析方法叶绿素a的测定[46]:滤膜经8mL90%的丙酮溶液在4°C下避光提取24h,离心10min后取其上清液,以90%的丙酮溶液作为空白,采用紫外分光光度计测定630、647、664nm波长下的吸光度NH4-N采用营养盐自动分析仪(Bran-LubbeAAⅢ,Germany)测定[47]SOD酶的测定[48]:依据SOD酶在光下对抑制氮蓝四唑(NBT)的还原作用来确定SOD酶的活性,测定560nm下的吸光度CAT酶的测定[48]:依据CAT酶可在磷酸缓冲液中催化H2O2,在240nm波长下,可用H2O2的减少速率来确定CAT的活性即以A240nm每分钟减少0.01为1个CAT酶活性单位(U·mg-1·min-1)1.4数据处理采用Slogistic2生长模型计算东海原甲藻和米氏凯伦藻的终止生物量和最大生长速率,通过Origin8.5软件(TheMicrocalInc.)拟合生长曲线,公式如下[49]:Bt=Bf1+Bf−B0B0e−4μmaxtBf。

其中:Bt为t时刻的生物量(chla,μg·L-1);Bf为终止生物量(chla,μg·L-1);B0为初始生物量(chla,μg·L-1);μmax为最大生长速率(μg·L-1·h-1)氮摄取通常用Michaelis-Menten方程计算,而为了覆盖摄取和生长情况,本文采用Monod方程[50]并将其修改为:dCdt=Vmax(C−Cmin)C+Ks−Cmin其中,dCdt:氮吸收速率(μmol·L-1·h-1);Vmax:最大氮吸收速率(μmol·L-1·h-1);C:底物浓度(μmol·L-1);Cmin:最小浓度阈值(μmol·L-1);Ks:半饱和常数(μmol·L-1)采用非线性微分系数模拟方法拟合修正的Monod方程,基于Matlab的最小二乘法,并用Matlab2017拟合吸收曲线本文通过SPSS22.0软件(SPSSInc)对结果进行T检验来判断数据是否存在显著性差异,并设置显著性差异水平为α=0.052、结果2.1生长状况图2为东海原甲藻和米氏凯伦藻在NH4-N和不同pH条件下的生长曲线东海原甲藻和米氏凯伦藻分别于第2天和第3天开始快速生长进入指数生长期,并分别于第5天和第7天进入稳定生长期,此期间,东海原甲藻和米氏凯伦藻的chla浓度达到峰值,在pH=8.10条件下出现最大值(15.64和46.77μg·L-1),其次是pH=7.81处(9.75和43.17μg·L-1),在pH=7.45处chla浓度有最小值(7.45和8.62μg·L-1)。

随后,东海原甲藻和米氏凯伦藻分别于第8天和第11天开始死亡,进入死亡期在高酸化条件(pH=7.45)下,米氏凯伦藻的生长受到极大限制Slogistic2生长模型拟合结果表明,在NH4-N条件下,东海原甲藻和米氏凯伦藻的终止生物量和最大生长速率均随pH的下降而降低(见图3)具体表现为,在pH=8.10处,东海原甲藻和米氏凯伦藻的终止生物量分别为15.76和49.76μg·L-1,最大生长速率分别为0.182和0.357μg·L-1·h-1;在pH=7.81处,东海原甲藻和米氏凯伦藻的终止生物量分别为8.66和43.17μg·L-1,最大生长速率分别为0.076和0.250μg·L-1·h-1;pH值为7.45时,藻类生长受到极大的限制,东海原甲藻和米氏凯伦藻的终止生物量分别为7.67和7.56μg·L-1,最大生长速率分别为0.067和0.093μg·L-1·h-1(见表2)与自然条件下(pH=8.10)相比,东海原甲藻在pH=7.81处的终止生物量和最大生长速率分别下降了45.0%和58.2%,在pH=7.45处下降了51.3%和63.2%;米氏凯伦藻在pH=7.81处的终止生物量和最大生长速率分别下降了13.2%和30.0%,在pH=7.45分别下降了84.8%和73.9%。

显著性分析表明,东海原甲藻在pH=7.81和pH=7.45处的终止生物量和最大生长速率显著低于(p<0.05)pH=8.10处,米氏凯伦藻在pH=7.45处的终止生物量和最大生长速率均显著低于(p=<0.05)pH=8.10处的两个参数,且米氏凯伦藻的终止生物量和最大生长速率显著高于(p<0.05)东海原甲藻2.2氮吸收动力学图4为东海原甲藻和米氏凯伦藻在不同pH条件下对NH4-N的吸收曲线,NH4-N分别在96和168h内被快速吸收Monod方程拟合结果表明,东海原甲藻和米氏凯伦藻的最大氮吸收速率随pH的下降而降低,半饱和常数和最小浓度阈值随pH的下降而升高具体表现为,在pH=8.10处东海原甲藻和米氏凯伦藻的最大氮吸收速率有最大值(0.59和0.39μmol·L-1·h-1),其次为pH=7.81处(0.46和0.34μmol·L-1·h-1),在pH=7.45处东海原甲藻的最大氮吸收速率有最小值(0.38和0.24μmol·L-1·h-1)(见图5(A))显著性分析表明,东海原甲藻和米氏凯伦藻在酸化(pH=7.81和pH=7.45)条件下的最大氮吸收速率显著低于(p<0.05)正常海水条件下,且东海原甲藻的最大氮吸收速率显著高于(p<0.05)米氏凯伦藻。

在pH=7.45处东海原甲藻和米氏凯伦藻的半饱和常数有最大值(1.36和7.81μmol·L-1),其次为pH=7.81处(0.39和2.31μmol·L-1),在pH=8.10处有最小值(0.24和1.57μmol·L-1)(见图5(B))显著性分析表明,米氏凯伦藻在pH=7.81和pH=7.45处的半饱和常数显著高于(p<0.05)pH=8.10处,且其在pH=7.45处的半饱和常数显著高于(p<0.05)东海原甲藻在pH=8.10处东海原甲藻和米氏凯伦藻的最小浓度阈值有最小值(1.。