基因工程的基本程序丁.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,基因工程的概念,基因工程的别名,操作环境,操作对象,操作水平,基本过程,结果,DNA重组技术,生物体外,基因,DNA分子水平,剪切,拼接,导入,表达,获得符合人们需要的新产品,对基因进行操作的“手术刀”、“缝合针”、“运输工具”分别是什么物质？有何作用？,基因工程的剪切、拼接、导入、表达的具体过程是怎么样的呢？,基因工程的基本操作程序（一）,基因工程的基本操作程序,1、目的基因的获取,2、基因表达载体的构建,3、将目的基因导入受体细胞,4、目的基因的检测与鉴定,剪切：,拼接：,导入：,表达：,一、目的基因的获取,目的基因：,主要指,编码蛋白质,的结构基因.,例如：,苏云金杆菌抗虫基因,人胰岛素基因,种子贮藏蛋白基因,植物抗病基因,什么是目的基因？,目的基因的来源？,1、从自然界中已有的物种中分离,2、人工方法合成,获取目的基因的常用方法：,1、从基因文库中获取目的基因,2、利用PCR技术扩增目的基因,获取目的基因的常用方法：,1、从基因文库中获取目的基因,什么是基因文库？,将含有某种生物不同基因的,许多DNA片段,导入受体菌的群体中,储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因,为什么要构建基因文库？,直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗？,提示：,如果,所需要的目的基因的序列完全不知，或只知道目的基因序列的一段，或想从一种生物体内获得许多基因，或者想知道这种生物与另一种生物之间有多少基因不同，或者想知道一种生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同，或者想得到一种生物的全基因组序列，往往就需要构建基因文库。

基因文库种类,基因组文库：,含有某种生物的全部基因,部分基因文库（如cDNA文库）,：,含有某种生物的一部分基因,如何构建基因组文库和部分基因文库呢？,限制酶,基因组DNA,基因重组,转化细菌,体外包装,1),基因组文库,基因文库,提取某种生物的,全部DNA,限制酶切割,一定大小的DNA片段,与载体连接,导入受体菌中,储存,基因组文库,2),部分基因文库（cDNA文库）,基因重组,反转录酶,mRNA,cDNA,某种生物的单链mRNA,反转录酶,互补的单链DNA,DNA聚合酶,双链CDNA片段,与载体连接,导入受体菌种,储存,CDNA文库,如何从基因文库中获取所需要的基因？,依据：目的基因的有关信息如：根据,基因的核苷酸序列,基因的功能基因在染色体上的位置,基因的转录产物mRNA,基因翻译产物蛋白质,等特性2、,利用PCR技术扩增目的基因,一段,已知,的目的基因序列,通过2,n,形式扩增获取大量的目的基因,DNA复制（体外）,碱基互补配对原则,4种脱氧核苷酸,PCR仪,Taq酶（耐热的DNA聚合酶）、引物等,目的：,原理：,原则：,原料：,场所：,条件：,过程：,a、DNA,变性（90-95）,：双链DNA模板,在热作用下，_,断裂,，形成_,b、退火（,复性,55-60,）：系统温度降低，,引 物与DNA模板结合,，形成局部_。

c、,延伸（70-75,）：在,Taq酶,的作用下，从,引物的5端3端延伸，合成与模板互补,的_氢键,单链DNA,双链,DNA链,质粒,DNA分子,限制酶处理,一个切口,形成两个黏性末端,或平末端,两个切口,获得含有相同黏性末端的目的基因,DNA连接酶,重组DNA分子（重组质粒）,同一种,二.基因表达载体的构建,(一)过程:,科学家在培育抗虫棉时，经历了多次失败，才获得成功起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花体内没有表达然后在插入抗虫基因的质粒中插入,启动子,(抗虫基因首端)，导入棉花受精卵，长成的棉花植株还是没有抗虫能力科学家又在有启动子、抗虫基因的质粒中插入,终止子,(抗虫基因末端)，导入棉花受精卵，结果成长的植株，有了抗虫能力资 料:,作为基因表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？,基因表达载体的组成：,目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用a、目的基因,b、启动子,c、终止子,d、标记基因,复制原点,阅读与思考：,启动子、终止子有何作用？,标记基因有什么作用？,启动子：,位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能,驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质,终止子：,位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，,能终止mRNA的转录,标记基因,的作用是,为了,鉴别,受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来,启动子与起始密码子？终止子与终止密码子？,启动子和终止子：DNA上,启动子：驱动转录,终止子：终止转录,起始密码子和终止密码子：mRNA上,起始密码子：驱动翻译,终止密码子：终止翻译,阅读与思考：,基因的运载体、目的基因、启动子、终止子等都是DNA片断，如何将它们连接起来？,载体,与,表达载体,的区别？,二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。

表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构,用到的工具酶？,既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键,三将目的基因导入,受体,细胞,常用的受体细胞：,动植物细胞、大肠杆菌、土壤农杆菌、枯草杆菌等将目的基因导入受体细胞的原理？,借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径转化,目的基因进入_内，并且在 受体细胞内维持_和_的过程,受体细胞,稳定,表达,1、将目的基因导入植物细胞的方法：,（1）,农杆菌转化法,农杆菌特点：,易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力,原理：Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上目的基因,Ti质粒的T-DNA,重组,构建表达载体,转入,农杆菌,导入,植物细胞,a、d指的是什么过程？,农杆菌转化法示意图,（2）基因枪法,基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法3）花粉管通道法,植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。

2、将目的基因导入动物细胞,方法：显微注射法,程序：,(目的基因)表达载体 取卵（受精卵）显微注射 新性状动物,3、将目的基因导入微生物细胞,原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少,方法：,用Ca,2+,处理细胞 感受态细胞 表达载体与感受态细胞混合 感受态细胞吸收DNA分子,思考与探究：,利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？,有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的深度思考：,如何筛选出被重组质粒侵入的受体细胞青霉素培养基,青霉素抗性基因,思考：,1、受体细胞摄入DNA分子后就说明目的基因完成了表达吗？,2、目的基因是否稳定的存在于转基因生物并按人们的预期进行表达，需要在那些水平上进行检测？,四：目的基因的检测与表达,分子,水平,检测,检测转基因生物染色体的DNA,上是否插入了目的基因,检测目的基因是否转录出了mRNA,检测目的基因是否翻译成蛋白质,方法,方法,方法,DNA分子杂交技术,分子杂交技术,抗原-抗体杂交技术,1、提取受体生物DNA，并解旋成单链；,2、用标记了放射性同位素的目的DNA片段单链作为探针；,3、检测两者是否进行杂交；,A-,A-,32,P,T-,T-,C-,G-,T-,-G,32,P,-T,-T,-A,-A,-C,-A,X1,C-,C-,A-,G-,T-,T-,A-,X2,-G,-G,-T,-C,-A,-A,-T,Y1,A-,A-,T-,T-,C-,G-,T-,Y1,-T,-T,-A,-A,-G,-C,-A,探针,待测DNAX,待测DNAY,待测DNAY与探针DNA相同,分子,水平,检测,个体,水平,鉴定,检测转基因生物染色体的DNA,上是否插入了目的基因,检测目的基因是否转录出了mRNA,检测目的基因是否翻译成蛋白质,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,方法,方法,方法,DNA分子杂交,mRNA-DNA 分子杂交,抗原-抗体杂交,若不能表达，要对抗虫基因再进行修饰。

例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分当它的成分异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症假如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的-珠蛋白，想一想，应如何进行设计？,尝试设计,1）获取小鼠-珠蛋白基因的编码序列（cDNA）2）将cDNA、在大肠杆菌中可以适用的启动子、终止子、抗四环素的基因、质粒等，构建成一个表达载体3）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌如果表达载体未进入大肠杆菌中，大肠杆菌会因不含有抗四环素基因而死掉；如果培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明-珠蛋白基因已进入其中4）培养进入了-珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎后检测-珠蛋白含量，若符合要求，则可用于生产归纳:基因工程的基本操作程序,获取目的基因,从基因文库,利用,PCR,化学方法人工合成,构建基因表达载体,目的基因、启动子、终止子、标记基因,将目的基因导入受体细胞,农杆菌转化法、显微注射法,目的基因的检测与鉴定,检测：是否插入、转录、翻译,鉴定：,。